高端粒酶活性BMMSC中Wnt/β-catenin信号通路对骨向分化的调控机制研究

Bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) as adult stem cells have in general low or undetectable levels of telomerase. Recently, a new subset BMMSC of high telomerase activity BMMSC (tBMMSC) was found, which hold higher telomerase activity than regular BMMSC, rapidly self-renewing and multipotential differentiation. Our early studies testified that BMMSC treated by aspirin, an effective telomerase activator, hold higher bone-forming capacity. Therefore, we speculate that tBMMSC also hold higher bone-forming capacity and may have a greater advantage in repairing skull defect. tBMMSC maintain high expression of telomerase reverse transcriptase (TERT), and TERT can activate Wnt/β-catenin Signaling Pathway which plays an important role in bone formation and reconstruction directly. But the mechanism of Wnt/β-catenin signaling pathway modulates the osteogenic differentiation in tBMMSC remains to be revealed. The project intends to investigate the biological characteristics and osteogenic potential of tBMMSC and detect the levels of core proteins of Wnt/β-catenin signaling pathway in tBMMSC. Based on the results of activation or inhibition of Wnt/β-catenin classic signaling pathway, the project will further reveal the mechanism of Wnt/β-catenin signaling pathway modulates the osteogenic differentiation in tBMMSC.

骨髓间充质干细胞(BMMSC)为成体干细胞，其端粒酶活性极低，而新发现的BMMSC的亚类——高端粒酶活性的BMMSC (tBMMSC)，具有较高的增殖能力及自我更新能力。前期实验中我们证实阿司匹林通过增强BMMSC端粒酶活性从而促进其骨向分化，因此推测tBMMSC亦具有较强的骨向分化能力，且在颅骨缺损修复方面有较大优势。tBMMSC高表达端粒酶逆转录酶(TERT)，TERT可以直接调控Wnt/β-catenin信号通路，研究证实该通路在骨的形成与改建过程中发挥了重要作用，那么在tBMMSC中Wnt/β-catenin通路对骨向分化的作用及机制尚待进一步探讨。本课题拟以tBMMSC为研究对象，对其生物学行为和骨向分化进行研究，检测Wnt/β-catenin通路中核心蛋白在tBMMSC中的表达，并通过上调和抑制该通路，揭示Wnt/β-catenin信号通路在tBMMSC中对骨向分化的调控机制。

经过反复多次实验，我们成功分离培养了高端粒酶活性的BMMSC (tBMMSC)，然后以常规培养的BMMSC作为对照组，阿司匹林诱导细胞作为阳性对照组，通过体内实验和体外实验对其生物学行为和多向分化能力的检测，发现tBMMSC不仅具有较高的增殖能力，而且具有较强的成骨、成脂和成神经能力。然后我们多次实验反复了验证高端粒酶活性骨髓间充质干细胞中Wnt/β-catenin经典信号通路在骨向分化过程中的作用，首先检测β-catenin和GSK3β在三组细胞中的表达，推测tBMMSCs成骨能力的提高与tBMMSCs中GSK3β磷酸化增多和下游Wnt/β-catenin信号通路激活有关。然后我们通过双荧光素酶报告基因检测和siRNA转染证实，tBMMSCs中GSK3β的过度磷酸化，继而引发下游Wnt/β-catenin信号通路的激活和成骨能力的增强。在第四部分实验中，我们主要研究高端粒酶活性骨髓间充质干细胞中Wnt/β-catenin经典信号通路对骨向分化的调控机制，通过Wnt3a上调和DKK-1抑制Wnt/β-catenin信号通路后，从RNA水平和蛋白水平以及形态学实验表明，Wnt3a 上调Wnt 信号通路后tBMMSCs成骨分化能力增强，增殖能力增强；DKK-1 抑制Wnt 信号通路后tBMMSCs 成骨分化能力减弱，增殖能力降低。