糖皮质激素对双带小丑鱼kisspeptin信号系统调控的分子机制研究

Anemone fish (Amphiprion clarkii) is an interesting research model because of its social-dependent sex change behavior. But the molecular mechanism of how stress hormones (glucocorticoid) influence reproductive physiology via kisspeptin signal system is still unknown. In the present project, the expression pattern of kisspeptin signaling and glucocorticoid will be identified by molecular cloning and ELISA. Secondly, the expression profiles of two kisspeptin genes will be examined after the treatments of glucocorticoid and glucocorticoid receptors inhibitor in male or female. Then, localization of two kiss genes in brain, as well as co-localization among kiss genes and GRs will be carried out by in situ hybridization, and the expression of GRs in kisspeptin neurons will be analyzed with real-time PCR combined with the laser capture microdissection (LCM) technique. Finally, the promoters of two kiss genes will be cloned and characterized, and the transcription factor binding site of GR will be identified so as to elucidate the molecular mechanism of glucocorticoid regulation on kisspeptin genes. Our project will describe the regulation on social-dependent sex change, and provide a solid theoretical foundation for artificial sex control on many social sex reversal fish.

小丑鱼具有独特的社会性性逆转现象，研究表明，社会应激反应通过糖皮质激素作用于kisspeptin信号系统，进而参与性腺分化及性逆转过程，但具体的调控机制尚未清楚。本课题通过分子克隆等技术，鉴定双带小丑鱼的kisspeptin系统和糖皮质激素在不同性腺分化阶段及性逆转过程的表达模式；通过外源糖皮质激素处理和糖皮质激素受体拮抗剂处理，从生理水平探讨糖皮质激素对鱼类kiss基因表达的调节作用；通过原位杂交和激光显微切割等技术，研究脑区kisspeptin神经元的分布及糖皮质激素受体在kisspeptin神经元上的表达情况，从细胞水平为糖皮质激素调控kiss基因表达提供直接证据；通过克隆及分析两种kiss基因启动子，并确定糖皮质激素的作用位点，分析糖皮质激素对kiss基因表达调控的分子机制。本课题对于阐明小丑鱼社会性性逆转的调控机理具有重要意义，并为实现社会性性逆转鱼类的人工性别调控提供理论指导。

克氏双锯鱼（Amphiprion clarkii）具有独特的社会性性逆转现象，社会应激能通过糖皮质激素受体调控生殖轴上游kisspeptin系统，进而影响性腺分化及发育。对克氏双锯鱼不同社会地位个体的性腺进行观察比较，总结性腺发育的阶段分期；鉴定克氏双锯鱼kiss/kissr系统，结果显示，非功能雄性个体的下丘脑和垂体kiss2基因表达量、血浆雌激素和雄激素水平显著高于统治地位的雌性和功能雄性个体，提示kiss2参与了社会压力对克氏双锯鱼性腺发育的调控；鉴定克氏双锯鱼糖皮质激素受体（gr）基因，结果显示，三种社会地位克氏双锯鱼中，非功能雄性个体下丘脑gr2基因表达量最高，而gr1基因表达无显著差异，提示社会压力可能通过gr2基因表达的增加来抑制性腺发育；鉴定克氏双锯鱼kiss及gr基因在其脑中的表达分布，结果显示，kiss2比kiss1基因表达分布更广泛，且表达强度更大，同时，Kiss1/Kiss2神经元上共表达gr1和gr2基因，提示下丘脑侧隐窝核背侧（NRLd）和松果体缰背部核团（NHd）表达的kiss基因在调节压力与生殖中起重要作用；分析糖皮质激素对克氏双锯鱼kiss基因反馈调节的作用机制，结果显示，注射皮质醇能使脑中两种kiss基因及两种gr基因表达增加，且在kiss2基因启动子上发现糖皮质激素受体结合位点（GRE）存在。进一步研究发现，当GR1/GR2存在时，外源皮质醇（地塞米松）能激活kiss2启动子下游信号。而定点突变位于-573位点的GRE，地塞米松无法通过GR1激活kiss2启动子信号。定点突变位于-883、-860、-851和-843位点的任一GRE，地塞米松均无法通过GR2激活kiss2启动子信号。提示，皮质醇可能通过GRE-依赖途径对kiss2基因进行转录调节。本课题研究糖皮质激素对克氏双锯鱼kisspeptin信号系统调控的分子机制，对阐明社会压力对性腺分化与发育调节的机理具有重要意义。