基于肿瘤新靶点PAK4激酶结构的药物分子设计与其作用机制研究

Cancer is a leading cause of mortality worldwide, and deaths from cancer are projected to continue rising. Lung, stomach, liver, colon and breast cancer cause the most cancer deaths each year. Therefore, the call for the discovery of less toxic, more selective, and more effective agents to treat cancer has become more urgent. P21-activated kinase (PAK4) executes key functions in tumor invasion and metastasis, and thus emerges as an attractive target for cancer therapy. In our previous studies, the protein-ligand interactions,virtual library screening and biological assay were investigated for PAK4 inhibitors discovery. In this project, our aim is to design more potent and selective PAK4 inhibitors by means of techniques from areas of computational chemistry, cell biology and structural biology. The studies will be focused on modification of the lead compound for generating more diverse structures according to the ATP-binding site features, and prediction of the activities and drug-likeness with the aid of molecular docking and ADME/Tox evaluation. The structures with good records of predictive activities and drug-likeness will be synthesized for further in vitro and in vivo biological assay to validate the inhibitory effects. Furthermore, the structural details of PAK4-ligand complex will be identified through X-ray crystallography and NMR experiments. The observed binding modes will be used for further fragment-based inhibitor design. Besides, the above reasearch modes can be used in the virtually screen of the clinic drugs towards PAK4 to discovery their new functions on chemotherapy. Hopefully, our studies will pave a road towards discovering some potent, orally available small-molecule PAK4 inhibitors with significant promise for the treatment of human cancers.

恶性肿瘤的治疗长期以来是一个世界性的难题，抗肿瘤新药研发是创新药物研究的热点领域。PAK4激酶在肿瘤细胞侵袭转移中具有重要作用，设计选择性PAK4抑制剂，对发现肿瘤临床治疗药物具有重大意义。在课题组前期对PAK信号通路进行大量研究工作的基础上，针对现有抑制剂结构无特异性、活性无选择性等缺点，结合计算化学、细胞生物学和结构生物学技术，分析靶酶活性位点特征，设计新的抑制剂结构，通过分子对接对新结构进行活性预测，计算其理化性质来评价其成药性。对表现优异的化合物进行化学合成，测定化合物的理化性质，并进行体内和体外抗肿瘤活性测试和作用机制研究。实现X-射线单晶衍射解析PAK4与配体的复合物结构的突破，并通过NMR实验分析化合物片段与PAK4的作用方式，进行基于片段的药物设计。同时对现有上市药物进行相关研究，以发现现有药物的抗肿瘤新用途。该项研究为新型抗肿瘤药物的研发奠定了重要基础。

丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PKA4在肺癌和胃癌患者体内高表达，在肿瘤的侵袭转移中具有关键作用，是作为肿瘤转移药物的潜在靶标，开发PAK4抑制剂是一个全新的抗肿瘤转移新药研究方向，还没有上市药物。从2007年开始，本课题组在国家863项目的资助下，通过系统生物学和计算生物学方法，论证PAK4作为肿瘤转移靶标的可行性，并通过虚拟筛选进行了先导化合物的发现和优化工作。.在本项目研究中，基于前期通过虚拟筛选发现的先导化合物结构，通过分析PAK4激酶活性位点氨基酸特征，设计并合成了5类共700余个新型 PAK4 抑制剂，通过HTRF技术和SPR技术，在酶水平检测对PAK4的抑制活性，发现了一批高活性化合物，活性最强的化合物B22达到IC50=9 nM，而且对PAK1的IC50=3212nM，选择性达到346倍，这是PAKs家族蛋白酶选择性方面的重要突破。生物学机制研究发现，该化合物对肺癌细胞迁移和侵袭均有较明显的抑制作用，可抑制肺癌细胞进入S期，对A549细胞增殖及G1/S期相关蛋白表达水平的影响依赖于PAK4激酶活性。采用SelectScreen®激酶活性筛选平台Z-Lyte技术对48种代表性激酶进行了激酶组选择性实验显示其具有良好的激酶选择性，为特异性较强的选择性PAK4抑制剂。成药性评价发现，化合物B22具有良好的类药参数和物理化学性质，在大鼠血浆内具有良好的稳定性，对hERG抑制活性较弱（抑制率42%），产生hERG相关毒副作用的风险较低，但生物利用度有待提高。实现了PAK4与3个化合物（PDB编号：5XVF, 5XVA 和5XVG）的X-射线单晶衍射结构解析，有助于加深本课题中化合物与PAK4的作用机制，以及更进一步设计强效PAK4抑制剂。.构建了PAK4转基因，Wnt转基因，以及PAK4/Wnt双转基因小鼠模型，经检测，PAK4等目的基因均呈转基因阳性，Wnt单转基因及Wnt/PAK4双转基因F3代小鼠已经有表型出现（胃炎/胃癌）。目前已获得F4代小鼠。接下来拟利用小动物活体成像仪及BRET技术，检测活性药物对活体动物体内蛋白质相互作用的影响，和抑制肿瘤细胞侵袭转移的作用。.本项目发表SCI期刊论文12篇，发表会议论文6篇，受邀进行大会报告3次，申请中国专利2项，国际专利1项申请中。