长白山野生猕猴桃蛋白酶分离纯化及对肉嫩化机制的研究

酶类嫩化剂多年来一直受到肉类加工行业的重视，其中植物蛋白酶，安全性最高，效果最佳，应用最广。长白山野生猕猴桃蛋白酶是继木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等后发现的有待开发利用的新的植物蛋白酶。因此,本项目以长白山野生猕猴桃为原料，以分离纯化对肉嫩化效率高的蛋白酶为目的，应用生物活性物质筛选技术与分离沉淀、凝胶层析、离子交换层析、亲和层析等交叉分离技术相结合，分离提纯蛋白酶，并对该酶进行特性分析、分子量测定和定性鉴定。此外，将纯化的蛋白酶以肌动球蛋白为酶解对象，对酶解产物分离后进行氨基酸序列分析，确定酶的作用位点和作用特性，阐明该蛋白酶对肉的嫩化机制。同时，初步建立相应的长白山野生猕猴桃的特征信息库，为把有开发前景的长白山野生猕猴桃所特有的蛋白酶发展成天然的肉嫩化剂奠定基础。

软枣猕猴桃属于猕猴桃科、猕猴桃属，为多年生落叶藤本植物，是猕猴桃属中在中国地域分布最广泛的野生果树之一，在我国东北三省的资源最为丰富。软枣猕猴桃不仅野生资源丰富，营养价值高，还具有多种保健功能，应用开发前景巨大。植物蛋白酶对肌肉的纤维蛋白和胶原蛋白有较强的水解作用，软枣猕猴桃蛋白酶是继木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等后发现的有待开发利用的新植物蛋白酶。目前，对长白山野生软枣猕猴桃的研究仅涉及文献考证、分布状况、生物学特性调查、商品调查及组培、栽培等方面，无论从广度或深度上，与软枣猕猴桃所具有的价值相比是远远不够的。本项目以长白山野生软枣猕猴桃为原料，对软枣猕猴桃蛋白酶进行了提取、分离纯化与特性研究，对粗蛋白酶分解肌动球蛋白与其嫩化牛肉机制进行了研究。主要结果如下：采用硫酸铵沉淀法提取软枣猕猴桃粗蛋白酶，从成熟度Ⅳ期的软枣猕猴桃中提取蛋白效果最佳；在pH值为7.0、温度为60℃、时间为15 min条件下对肌动球蛋白的分解效果最好；通过正交试验确定软枣猕猴桃粗蛋白酶在酶用量0.05％、处理温度50℃、处理时间1 h条件下对牛肉嫩化效果最佳；利用Sephdex G-25凝胶过滤层析和DEAE离子交换层析对软枣猕猴桃粗蛋白酶进行分离纯化，纯化后的蛋白酶比活力达到53428 U/mg，纯化倍数为25.5倍，活力回收为9%；并用质谱定性鉴定及N-端测序后NCBInr数据库中BLAST在线软件分析后得出软枣猕猴桃蛋白酶是N-端序列为vlpdy vdwrs agavv的猕猴桃蛋白酶，分子量为23.8KD。本项目的研究可为新型酶制剂在食品中的开发和应用奠定基础，也为充分地利用长白山野生猕猴桃资源，发挥地区优势，实现生态效益、经济效益和社会效益的共同提高，以及延边地区的生态建设和长白山野生猕猴桃资源的可持续利用、开发做出有效贡献。