内质网IRE1通路介导镉致小鼠卵巢颗粒细胞凋亡的作用机制

Cadmium(Cd) is a widespread toxic pollutant of environmental concern. Preliminary study showed that exposure to this heavy metal can lead to apoptosis of mouse ovarian granulosa cells, while the underlying mechanism remains unclear. In this prensent study, we will explore the apoptosis of ovarian granulosa cells and the endoplasmic reticulum(ER) stress induced by cadmium, and thus investigate the regulation effects of different signaling pathways in ER stress and mitochondrial pathway in Cd-induced granulosa cell apoptosis. We will then observe the protection of ER stress in Cd-exposed ovary after the antioxidant treatment and explore the role of ROS in Cd-induced ovarian ER stress. We will also observe the inhibition of pathways involved in granulosa cell apoptosis by ER stress chaperon, and then explore the effect of different pathways of ER stress in Cd-induced granulosa cell apoptosis. By inhibiting the ER stress signaling molecular IRE1 with siRNA and RNase and kinase enzyme activity with their inhibitors respectively, we will mainly explore the mRNA decay of Bcl2 family via IRE1 RNase RIDD pathway and protein phosphorylation of JNK and memebers of Bcl2 family via IRE1 kinase pathway, and then induced cell apoptosis via mitochondrial pathway. We will finally explore the mechanism of IRE1 pathway involved in Cd-induced mouse granulosa cell apoptosis. This study will provide theoretical basis for exploring molecular mechanism of Cd-induced apoptosis of ovarian granulosa cells and also the preventive actions.

镉是一种广泛存在于环境中的重金属污染物。前期研究发现，镉暴露能导致小鼠卵巢颗粒细胞凋亡，但其作用机制尚未阐明。本课题拟对镉引起的小鼠卵巢颗粒细胞凋亡及内质网应激进行研究，探索内质网应激不同信号通路及线粒体通路对颗粒细胞凋亡的调控作用；通过观察抗氧化剂对镉致卵巢内质网应激的保护效应，阐明活性氧在镉致卵巢内质网应激中的作用；通过观察内质网分子伴侣对镉调控颗粒细胞凋亡通路的拮抗作用，阐明内质网应激不同信号通路在镉诱发小鼠颗粒细胞凋亡中的作用；通过siRNA沉默内质网信号分子IRE1、特异性抑制剂阻滞IRE1核酸酶及激酶活性，重点阐明IRE1分别通过其核酸酶RIDD通路降解Bcl2家族mRNA和激酶通路磷酸化JNK和Bcl2家族蛋白最终引发线粒体凋亡通路，从而阐明内质网IRE1通路在镉致小鼠颗粒细胞凋亡中的作用。本课题为最终阐明镉在卵巢颗粒细胞凋亡中的作用机制和其预防措施提供理论依据。

镉是一种广泛存在于环境中的重金属污染物。前期研究表明，镉暴露能导致小鼠卵巢颗粒细胞的凋亡，然而其生殖毒作用机制尚未阐明。本研究通过腹腔注射方法对3周雌性ICR小鼠采用不同剂量的CdCl2处理，以构建镉暴露导致卵巢损伤的模型。本研究通过HE染色和TUNEL法检测镉对卵巢的损伤作用及镉在小鼠颗粒细胞凋亡中的作用。同时，采用GSH试剂盒分别检测了对照组和处理组卵巢组织中GSH的含量。此外，用WB方法检测小鼠卵巢组织内质网应激、未折叠蛋白反应以及凋亡相关蛋白。体内实验结果显示，镉暴露能引起小鼠卵巢内质网应激及下游的未折叠蛋白反应，并引起颗粒细胞的凋亡；WB结果显示，镉处理组中卵巢中的内质网应激相关蛋白GRP78, p-IRE1表达量升高，凋亡相关蛋白cleaved-caspase3 和cleaved-PARP表达量升高。体外卵泡培养实验中，对3周小鼠进行PMSG处理后取卵泡进行微滴培养，并进行CdCl2染毒，结果发现，体外培养卵泡至12天，对照组卵泡发育良好，镉处理组卵泡发育缓慢，卵母细胞出现萎缩，或颗粒细胞散落导致卵母细胞排出等；体外原代细胞培养中，通过对3周小鼠进行PMSG处理48小时后，分离原代颗粒细胞，培养至贴壁，对其进行不同剂量的CdCl2暴露，24小时后，采用CCK8试剂盒检测细胞活力，结果发现，随着染毒剂量升高，处理组细胞死亡数逐渐增多；酶标仪OD 值检测结果显示，高剂量组中细胞活力明显下降；流式细胞仪检测结果显示，随着CdCl2剂量的升高，颗粒细胞凋亡随之增加。以上结果表明，镉能引起卵巢损伤，引起颗粒细胞凋亡，导致卵泡发育缓慢，而内质网应激IRE1通路可能参与镉引起的卵巢颗粒细胞凋亡。本研究通过小鼠模型探讨镉对小鼠卵巢损伤以及诱发卵巢颗粒细胞凋亡的机制，通过探索镉对小鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响，研究镉对参与细胞凋亡的内质网应激的调控作用。本研究与临床上相关疾病相互联系，但未能实现动物模型与临床试验数据的结合。本研究仍从理论上为镉在女性生殖过程中的毒性作用机制和临床疾病控制及生活预防措施上提供相关的证据和依据。