Cbx4在抗病毒固有免疫反应中的调节作用及机制研究

Innate immune response initiated by virus infection is strictly regulated by multiple negative and positive regulators.Cbx4/Pc2, a member of the polycomb group proteins, has been identified as a SUMO E3 ligase. Until now, the regulatory function of Cbx4 on antiviral innate immune response has not been characterized. Our previous studies found that overexpression of Cbx4 inhibited Sendai virus and poly (I: C) induced ISRE and IFN-beta activation. In this study, we will confirm the negative regulatory roles of Cbx4 by reporter assay or detection of downstream target gene expression levels in cells with overexpression or knockdown of Cbx4 expression or in Cbx4 gene knockout MEFs induced by Sendai virus or poly (I:C). We will try to find the target signal molecules of Cbx4 by coimmunoprecipitation and reporter assays. By the SIM motif mutants, we will answer whether the regulatory functions of Cbx4 is dependent on its SUMO E3 ligase activity. We will also detect whether Cbx4 promote the sumoylation of the target proteins ,as well as its influence on the ubiquitination and stability of the target protein and its transcriptional activity. Finally, we will confirm the regulatory function on antiviral immune response in conditional Cbx4 knockout mice.

病毒感染所激活的固有免疫通路,在多步骤受到严格调控。Cbx4/Pc2 是多梳蛋白家族成员，具SUMO E3 连接酶活性，但至今其在抗病毒固有免疫反应中的调节作用还完全未知。我们的前期研究发现过表达 Cbx4 可抑制仙台病毒以及 poly (I:C) 所诱导的 ISRE 和 IFN-beta 的激活，本研究将进一步通过过表达或 敲低 Cbx4 的表达，或利用 Cbx4 基因敲除的 MEF 细胞，通过报告基因、下游靶基因表达水平检测等多种手段确实 Cbx4 的负向调节作用。同时通过免疫共沉淀、报告基因检测等找到 Cbx4 作用的信号节点。机制分析构建 Cbx4的SIM 区缺失突变体，探讨其抑制作用是否依赖于其SUMO E3 连接酶活性，对作用的靶蛋白是否有促进其 SUMO 化修饰，以及对靶蛋白泛素化修饰和蛋白稳定性的影响，转录活性的影响。最后将通过Cbx4条件敲除小鼠体内观察其抗病毒免疫反应.

固有免疫是机体抵御病原微生物入侵的第一道防线，有效的免疫应答可以保证高效地清除病原微生物，而过强的免疫应答又有可能造成机体功能的紊乱，以及炎症、自身免疫病等疾病的发生。以RNA病毒感染为例，其核酸成分被RIG-I样受体识别后，通过一系列的级联反应，最终导致促炎症细胞因子以及I型干扰素的产生，从而发挥抑制病毒复制，控制感染的目的。为了使免疫应答有效可控，这一级联反应在多个层次上都受到严格地正负两方面的调节，理解这一过程的调节机制，对于未来发现炎症及相关疾病的治疗靶点具有积极的意义。.本研究 以多梳蛋白家族成员Cbx4/hPc2为研究对象，利用报告基因、Real-time PCR、Western Blot、ELISA、泛素化分析等多种实验手段，系统揭示了Cbx4 在抗病毒固有免疫反应中的负向调节作用及相关机制。我们的研究结果发现：过表达Cbx4能够抑制RNA病毒诱导的抗病毒免疫反应，促进RNA病毒的复制，而敲低或敲除Cbx4后I型干扰素产生上调，抑制RNA病毒的复制。进一步的研究发现Cbx4 在抗病毒固有免疫方面的负向调控作用不依赖于其苏木 E3连接酶的活性。机制分析发现Cbx4 作用于信号级联反应的转录因子IRF3水平，通过与之相互作用，并促进其泛素化降解从而发挥作用。动物实验表明，Cbx4f/f CD11c-Cre的小鼠比Cbx4f/f的小鼠有更强的抵抗VSV病毒感染的能力。总之，通过本研究，我们首次发现Cbx4 在抗病毒固有免疫中发挥重要的负向调控作用，这一作用拓展了Cbx4的功能，同时也为未来相关疾病的干预提供了新的潜在靶点。