胰腺癌相关基因MUC4启动子区抑制元件及其结合蛋白的鉴定和功能研究

胰腺癌预后极差，迫切需要寻找新的干预靶点。粘蛋白（MUC）家族成员之一，MUC4，是近年发现的胰腺癌相关基因，在正常胰腺和胰腺炎组织中不表达，在胰腺癌组织中出现异常表达，与胰腺导管腺癌的演进相关，因此探讨其在胰腺癌中表达调控的分子机制具有十分重要的意义。申请者在前期研究中发现在人MUC4启动子的-2501bp至-2600bp之间存在着一个很强的具有转录抑制作用的调控元件，这一抑制元件的存在使反映启动子转录活性的荧光素酶值下降10多倍。本项目旨在通过分子生物学手段鉴定这一抑制元件及其结合蛋白，并观察该结合蛋白对胰腺癌细胞内MUC4基因的调控作用及对细胞生物学行为的影响，从而进一步了解MUC4的转录和表达机制。通过本项研究，一方面可以发现MUC4这一重要基因的新的调控机制，进一步完善MUC4转录调控的理论，另一方面可以找到抑制MUC4基因表达的新靶点。

MUC4在正常胰腺和胰腺炎组织中不表达，在胰腺癌组织中出现异常表达，与胰腺癌的演进相关。我们在前期研究中发现在人MUC4启动子-2501bp至-2600bp间存在着一个很强的转录抑制元件，该抑制元件的存在使反映启动子活性的荧光素酶值下降10多倍。本项目通过分子生物学手段鉴定这一抑制元件及其结合蛋白，研究该结合蛋白对MUC4基因的调控作用及对胰腺癌细胞生物学行为的影响，并进一步探讨该结合蛋白在胰腺癌中的作用机制。我们通过启动子末端删除法构建了一系列5’端缺失突变体，结合荧光素酶报告基因技术将该抑制元件定位于MUC4启动子区-2530/-2521；通过电泳迁移率改变试验（EMSA）证明该抑制元件上有一种蛋白或蛋白复合物的结合；通过序列特异的DNA亲和层析及质谱技术分离、纯化及鉴定出该抑制元件结合蛋白为转录因子Yin Yang-1（YY1）；通过电泳超迁移试验及染色质免疫共沉淀试验（ChIP）明确了体外及体内YY1与MUC4启动子的相互作用；在Bxpc-3细胞中过表达YY1抑制MUC4基因启动子活性及内源性MUC4基因的表达；相反，干扰YY1表达促进MUC4基因的表达；此外，我们通过定量PCR、免疫组化及western blotting检测YY1在胰腺癌临床样本及本实验室胰腺癌细胞株中的表达，并分析YY1表达与胰腺癌临床参数的相关性，结果显示：YY1在胰腺癌样本及细胞系中高表达，且YY1表达水平与胰腺癌的预后相关；在Bxpc-3细胞中过表达YY1或干扰YY1表达对细胞的增殖无明显作用；在Bxpc-3细胞中过表达YY1促进细胞的凋亡，相反，干扰YY1表达抑制细胞的凋亡；在Bxpc-3细胞中过表达YY1抑制细胞的体外迁移与侵袭，相反，干扰YY1表达促进细胞的迁移与侵袭；通过裸鼠皮下成瘤模型及尾静脉注射转移模型证明：干扰YY1表达促进皮下肿瘤的生长，过表达YY1抑制Bxpc-3细胞在裸鼠体内的转移；通过数字化基因表达谱（DGE）测序、定量PCR验证、信号通路阻断试验及荧光素酶试验证明：YY1通过MUC4/ErbB2/p38/MEF2C途径抑制MMP10的表达，从而抑制Bxpc-3细胞的侵袭与转移。本项目鉴定了人MUC4基因启动子区的一个新的转录抑制元件及其结合蛋白YY1，证明了YY1在胰腺癌的演进中发挥肿瘤抑制作用，提示YY1可能成为胰腺癌的诊断、预后的指标及潜在的治疗靶点。