牛Nanog基因启动子区负调控元件功能的研究

本课题通过对分化细胞中Nanog基因抑制机制的研究,以发现解除抑制的方法为目的，期望发现一种诱导分化细胞生成iPS的新方法或新思路。采用双荧光报告分析技术，挖掘Nanog基因启动子上存在的负调控元件；通过生物信息学预测、酵母单杂交和DNA Pull-down Assay技术筛选结合在此负调控元件上的抑制因子，研究该抑制因子对 Nanog基因表达的调控机理，并以染色质免疫沉淀芯片技术进一步揭示该转录抑制因子在全基因组范围内的结合位点，借以绘制该抑制因子调节胚胎干细胞多能性的转录调控网络，并评价其在iPS诱导过程中重要程度；确定激活该转录抑制因子的信号通路，尝试找到一种可以有效抑制该转录因子活性或其激活途径的小分子抑制剂；并以此小分子抑制剂作为辅助诱导剂，研究其对胎牛皮肤成纤维细胞和乳腺细胞 iPS 的诱导效率的影响。

Nanog 是干细胞内与多能性维持相关的重要基因。本研究以牛皮肤成纤维细胞、小鼠胚胎干细胞以及畸胎癌细胞为实验材料，利用荧光素酶报告系统、RNA 干扰、实时定量 PCR、凝胶迁移实验、染色质免疫共沉淀等技术，全面、系统地探究牛Nanog 基因启动子区负调控元件及其功能。具体研究内容为：在Nanog基因启动子上游发现2个负调控元件，并且确定其负调控因子。进一步研究了负调控因子对Nanog的调节作用。本研究旨在找到一种能够在分化细胞中解除Nanog表达抑制效应的小分子化合物，为建立安全有效的iPS 提供诱导方法或思路，最终希望提高转基因牛胚胎发育率。