RelB在慢性B淋巴细胞白血病中的活化机制及作为药物敏感性预测指标的探讨

Constitutive classical NF-κB activation protects CLL cells from cell death and plays a critical role in the acquisition of resistance to chemotherapy. RelB, representing the alternative NF-κB activity, indeed plays an important role in the pathogenesis and progression of multiple hematological malignancies, However, the involvement of RelB in CLL is uncovered. Proteasome inhibitor bortezomib which targets the NF-κB signaling pathway is proposed as a promising therapeutic choice for multiple hematological malignancies. Bortezomib could induce apoptosis of fludarabine-refractory CLL cells in vitro. Our previous data revealed that RelB did exist in CLL cells, and high RelB activity indicated a worse prognosis, and confered survival advantages in vitro. What is the mechanism of constitutive alternative NF-κB activity in CLL? What is the biomarker of proteasome inhibitor-sensitivity to the CLL cells? Is it related to the alternative NF-κB activity? In this study, we will further analyze the status in components of the alternative NF-κB pathway and establish immortalized CLL cell lines. By using the CLL-stoma model to imitate in vivo conditions, we will comparatively analyze the distinctions of proteasome inhibitor-sensitivity to the CLL cells with different RelB activities. We will investigate the possibilities of RelB as a biomarker of proteasome inhibitor-sensitivity to the CLL cells.

持续活化的经典型NF-κB活性保护CLL细胞免于死亡并引起化疗耐药。非经典型NF-κB活性也确实在多种恶性血液病发生发展中起重要作用，但其在CLL中的作用仍不清楚。靶向NF-κB信号通路的硼替佐米对多种恶性血液病有效，并能在体外诱导氟达拉滨耐药的CLL细胞死亡。我们的预实验结果提示CLL细胞确实存在RelB的活化并影响CLL的预后，RelB活性增高体外支持细胞存活。那么，CLL中非经典型NF-κB持续性活化的机制是什么？CLL细胞对硼替佐米敏感的生物学指标是什么？是否与非经典型NF-κB活性有关？本课题将分析CLL中非经典型NF-κB信号通路上游关键分子及相关基因状态，建立永生化CLL细胞系，通过骨髓基质细胞与CLL细胞共培养模型，比较性分析不同RelB活性的CLL细胞对硼替佐米敏感性的差异，探讨RelB作为CLL细胞对硼替佐米敏感性的生物学指标的可能性，为CLL的治疗提供新的思路。

CLL表现为成熟单克隆性B淋巴细胞集聚在外周血、骨髓、淋巴结以及其他外周淋巴器官中。其生物学行为及临床特征存在很大的异质性。研究表明，持续性活化的经典性核转录因子κB（NF-κB）信号通路（以RelA为代表）有利于CLL细胞存活，并在CLL细胞的获得性耐药中发挥重要的作用。非经典性NF-κB信号通路中的代表性因子，RelB，在淋巴器官形成以及B细胞发育成熟过程中发挥关键性的作用。但RelB在CLL中的意义仍不清楚。.本课题通过qRT-PCR，Western blot，IRDye-EMSA 以及TransAM ELISA实验技术检测CLL中NF-кB的表达及活性状态，观察不同NF-κB活性状态的CLL骨髓原代细胞体外单独培养或与骨髓基质细胞共培养，有或无蛋白酶体抑制剂或氟达拉滨作用时，CLL 细胞的凋亡率变化，明确不同NF-κB活性状态的CLL骨髓原代细胞对蛋白酶体抑制剂敏感性差异的潜在作用机制。检测CLL标本NF-κB信号转导通路上游关键因子NOTCH1以及MYD88等的突变状态，建立敏感，方便快捷，高通量的高分辨溶解曲线突变检测方法，同时与直接测序进行验证，比较两种方法的一致性和敏感性差异。.研究结果表明，骨髓CLL细胞中不仅存在以RelA为代表的经典型NF-κB的活化，还存在以RelB为代表的非经典型NF-κB的活化。RelB活化程度在不同的CLL细胞中差异显著；在RelA活性增强的同时，高RelB活性赋予骨髓CLL细胞存活优势。CLL细胞与骨髓基质细胞共培养，通过诱导CLL细胞中RelA和RelB的表达来发挥对其体外存活的保护作用。RelB活性增强可增加CLL细胞对蛋白酶体抑制剂硼替佐米和MG-132的敏感性，而对氟达拉滨的敏感性无明显影响。本课题发现NF-κB家族中，不仅仅是RelA，而且RelB在骨髓来源的CLL细胞的生物学行为上也发挥重要的作用。RelB的活性强度与CLL的预后相关。另外，我们成功地建立了HRM突变检测体系，在133例CLL标本中，共检测到8 例NOTCH1突变以及6例MYD88基因突变，所有结果均经直接测序法验证，一致率达到100%。与直接测序法相比，HRM检测突变敏感性大大提高到1%，报告周期短，操作简便、低成本，无污染，结果准确可靠，并可以实现高通量地筛查，对临床了解CLL疾病状态，判断疗效和预后起到重要的指导作用。