完整糖肽上N-连接糖链结构的从头测序新技术研究

Protein glycosylation is involved in the sperm function throughout the whole process from spermatogenesis to maturation until fertilization. From the pilot studies, we found that there are a large numbers of special N-linked glycans in human sperm and seminal plasma. Characterization of the detailed structure of these sugar chains will be helpful for better understanding of the relationship between glycosylation and male reproductive health. At present, all established intact glycopeptide analysis methods perform the intact glycopeptide identification by matching the MS spectra with the known glycan database, and the identification result can only give the monosaccharide compositions of the glycans rather than the glycan structure information, so it is impossible to meet the basic needs of the characterization of special glycan structures in sperm and seminal plasma. In our previous studies, we have developed many new methods and software for glycoproteome and intact glycopeptide analysis. In this proposal, we will further develop new strategies and methods for de novo sequencing of both released N-glycans and the glycans still attached at the glycosylated peptide. In addition, we will design a new algorithm and a new software to achieve the high-throughput and automation of the glycan structure sequencing. The methods and software will be applied into N-linked glycoproteomic profiling of human sperm and seminal plasma, the methods can also be used for the detection of alteration of sperm glycoproteins and/or glycan structures associated with male infertility. Moreover, this methodologies would be helpful for the glycan structure analysis of O-linked glycans at the intact glycopeptide level in the near future.

蛋白糖基化全面参与精子发生、成熟直到受精的全过程。我们在前期预实验中发现人类精子和精浆中存在大量的特殊N-糖链结构，解析这些糖链精细结构有助于加深了解糖基化与男性生殖健康间的关系。目前已建立的完整糖肽分析方法都是通过与已知糖链数据库匹配的方式进行完整糖肽鉴定，且鉴定结果仅能给出糖链的单糖组成而非糖链结构信息，因此均无法满足精子和精浆中特殊糖链结构解析的基本需求。本项目拟在我们前期糖蛋白质组学方法学和完整糖肽分析软件开发研究的基础上，进一步建立可在完整糖肽上直接进行从头测序N-连接糖链结构的新方法，并借此开发糖链结构从头测序的新算法和新软件，以实现复杂样品中糖链结构分析的高通量和自动化。该方法将用于健康志愿者精子和精浆的N-糖蛋白质组分析，及男性不育症患者精子和精浆中糖蛋白和糖链结构的改变分析研究中。该方法体系的建立将有助于下一步建立类似的O-连接糖链结构解析方法。

蛋白糖基化与精子的发生、成熟以及受精的过程密切相关。先前的文献报道以及我们前期的研究结果发现精子中存在多岩藻糖的特殊N-糖链结构，准确地解析这些糖链的精细结构将有助于理解这些特殊的糖链在受精过程中的作用从而为进一步探索糖基化与男性生殖健康间的关系奠定基础。目前已有的完整糖肽的解析方法都是基于已有的糖链数据库进行匹配，且鉴定的精度仅限于糖链的组成而非糖链的精细结构。因此传统的完整糖肽解析方法无法满足精子和精浆中特殊糖链结构解析的基本需求。为此，本项目首先建立了一种完整糖肽水平上不依赖于糖链数据库的糖链结构鉴定的方法以及配套的软件StrucGP，我们分别在标准糖肽、标准糖蛋白以及鼠脑中验证了新方法的可靠性，在24个鼠脑的raw数据中，StrucGP总共鉴定到了5696个不同的完整糖肽，600个糖链结构。为了实现糖链结构的准确鉴定，我们对于每一个鉴定的糖链结构分别评估糖链组成的假阳性以及不同部分精细糖链结构可信度。我们将新方法应用于精子精浆的鉴定，构建了精子和精浆的完整N-糖肽数据库，并且初步建立了完整糖肽的PRM方法。在精子和精浆中共鉴定到16551种完整糖肽和1205种糖蛋白，其鉴定深度和广度都显著优于之前的研究。此外通过定量分析可育和不育男性精液中糖基化水平，发现不育男性精子和精浆中部分糖蛋白及位点特异性糖链结构发生了变化，尤其是LacDiNAc分支结构的下调和末端N-乙酰氨基葡萄糖结构的规律性上调，该糖链分支结构或可作为男性不育的潜在生物标志物。这为进一步探索糖基化及位点特异性糖链结构在精子功能及生殖健康中的作用奠定了坚实的基础。此外，我们开发了完整糖肽上N-连接糖链的数据库非依赖性结构解析方法，解除了蛋白质数据库的限制，对于蛋白质数据库缺失样本，非特异性酶切，存在其他翻译后修饰的N-连接糖肽的糖链结构解析具有独特的应用潜力。