大鼠5/6肾切除慢性肾衰竭模型中完整N-糖肽的定量组学分析

Chronic kidney disease (CKD) is a major public health threat worldwide. It is mainly characterized by the progressive decline in kidney function, which is associated with excess morbidity and mortality. Fortunately, deterioration of kidney function can be delayed and patient outcomes favorably affected if kidney disease is recognized and treated in a timely manner. Therefore, new biomarkers that provide quick, non-invasive and specific measurement are very essential. Current biomarkers for CKD, namely serum creatinine and urine protein, have limitations in serving these goals. Glycoproteomics has shown promising results in the identification of potential biomarkers in several diseases and our laboratory has established a NGAG method and related GPQuest software for the analysis of intact N-glycopeptides. In this project, a quantitative analysis of intact N-linked glycopeptides will be conducted in renal tissues of 5/6 nephrectomized rat models at multiple time points using the NGAG method. Thereafter, the typical changes of intact N-glycopetides at tissue level will be validated in the corresponding urine samples to identify the potential biomarkers. This study will be beneficial for the discovery of potential biomarkers for the early diagnosis of chronic renal failure and meanwhile help to understand the pathophysiological mechanisms of the disease.

慢性肾脏疾病是全球性的一个重要公共健康问题。目前临床上常用的标志物血肌酐和尿蛋白在疾病发展和对干预的反应方面有其局限性。因此，新的生物标志物对慢性肾脏疾病的监控和治疗十分必要。目前，糖蛋白质组在多种疾病的生物标志物研究中都已展现了良好的前景。本项目中，我们将利用完整N-糖肽分析的NGAG方法对大鼠5/6肾切除慢性肾衰竭模型肾脏组织中的完整糖肽进行为期20周10个时间点的定量组学分析，鉴定慢性肾衰竭发展中的特征性完整糖肽；并将利用平行反应监视技术进一步分析这些特征性完整糖肽在尿液中的变化情况，以期发现潜在的慢性肾衰竭早期生物标志物。本研究对于筛选慢性肾脏疾病的早期生物标志物与揭示慢性肾脏疾病的发病机制都有重要的意义，并为今后将要进行的临床样本分析和功能研究奠定基础。

慢性肾脏病是一个世界范围内的重要健康问题。尽管慢性肾脏病常由急性肾损伤引起，但是从急性肾损伤到慢性肾脏病的发展过程相关机制仍不完全清楚。作为最重要的蛋白质翻译后修饰之一，糖基化与多种疾病的发生发展密切相关。目前，糖基化改变在多种肾脏疾病的发生过程中均有所报道，然而糖基化研究在慢性肾脏病中仍十分有限。本研究中，我们应用定量糖蛋白质组学技术分析了位点特异性糖链的表达在慢性肾脏病发生发展不同阶段的动态变化。我们对10个不同时间点5/6肾切除大鼠肾脏样品中的完整糖肽表达谱进行了分析，并鉴定到表达丰富的平分型N-糖链。值得注意的是，我们看到数个纤维化相关的蛋白上的平分型N-糖链在慢性肾脏病发生过程中发生了显著变化。为验证平分型N-糖链的表达，我们建立了一种新的位点特异性平分型N-糖链鉴定方法。该方法主要通过对完整糖肽在质谱低能量HCD碎裂时所产生的两种特征性Y离子：[pep+HexNAc3Hex1]和[pep+ HexNAc3Hex1Fuc1]进行识别，从而实现平分型N-糖链的位点特异性鉴定。通过本方法，我们对5/6肾切除大鼠中鉴定到的完整糖肽上的平分型N-糖链进行了分析，并对上一部分的结果进行了验证。为进一步揭示平分型N-糖链在慢性肾脏病中的功能，我们建立了平分型N-糖链MGAT3糖基转移酶敲低与过表达的稳定人肾脏上皮HK-2细胞系。经过TGF-β1诱导纤维化并分析相关标志物的表达水平，我们发现平分型N-糖链与肾脏纤维化过程密切相关。经过蛋白质组和完整糖肽分析，最终我们确定了糖蛋白E-cadherin, Fibronectin和Tenascin C在蛋白水平和平分型N-糖链上同时发生表达变化，其很可能参与了平分型N-糖链对肾脏纤维化的调控过程。本研究利用糖蛋白质组学技术对慢性肾病发生发展过程中的糖基化表达动态变化进行了分析，并揭示了平分型N-糖链在慢性肾脏病中的调节作用，为阐明糖基化在慢性肾脏病发生发展中的作用提供了重要信息，并且为发现新的治疗靶点的提供了思路。