肝癌特征性完整N-糖肽的定量组学分析

Liver cancer is one of the most common tumors in China. However, the diagnosis of liver cancer using alpha-fetoprotein (AFP) as the biomarker is still limited by its low specificity and high false negative rate. Accumulating evidences revealed that the changes of site-specific protein glycosylation are associated with the development of cancers, while the previous liver cancer-related studies still focused on the expression level of glycoproteins or their overall glycosylation occupancies. Our newly developed NGAG method and GPQuest software could achieve the qualitative and quantitative analysis of thousands of intact N-glycopeptides from complex samples. In a preliminary study on human serum using our new methods, we found an atypical N-glycosylation site from albumin, which could be modified by two different glycans among population. Due to the fact that albumin and most other serum glycoproteins are secreted from liver, we speculated that the glycans on these serum glycoproteins might be changed with the development of liver disease. Therefore, in this study we will first compare the intact N-glycopeptides among tissues with cirrhosis, cancer as well as normal para-carcinoma from the same patients (at least 20 cases) to found the intact N-glycopeptide changes associated with liver cirrhosis or tumor. Then we will try to detect these changes in the sera from patients with liver cirrhosis or tumor to determine the potential of their clinical utilization. The study will be very helpful for the pathogenesis and new biomarker discovery studies of liver cancer.

肝癌是我国最常见的实体瘤之一，但目前基于肿瘤标志物甲胎蛋白的临床诊断仍存在特异性不强和假阴性率高等问题。越来越多的研究表明，一些糖蛋白特定糖基化位点上糖链结构的改变与肿瘤发生发展密切相关，但目前肝癌相关研究依然主要关注糖蛋白表达水平和糖基化程度的改变。我们最近建立的NGAG新方法结合GPQuest软件可实现复杂样品中上千种完整N-糖肽的定性定量分析。在对人血清N-糖肽的初步分析中，我们新发现白蛋白的Asn-68为非典型性N-糖基化位点且普遍被两种糖链修饰。由于白蛋白及多数血清糖蛋白由肝脏合成，我们推测这些糖蛋白上的糖链结构可能会随肝病的发生发展而改变。因此，本课题拟首先定量比较至少20例肝癌患者肿瘤切除块中的肿瘤、硬化和癌旁组织间的完整N-糖肽差异，筛选出肝硬化和肝癌相关糖肽，然后在对应的血清中验证其在临床检测中的应用价值。该研究对肝癌的发病机理和临床检测研究都具有重要的意义。

肝细胞癌是高发病率和死亡率的恶性肿瘤之一。尽管甲胎蛋白以及核心岩藻糖基化的AFP-L3已被广泛用作HCC早期诊断和评估，但AFP水平在HCC患者人群中差异很大，并且不同AFP水平HCC患者在分子、肿瘤的发生发展和临床造影等方面均存在差异。了解与AFP水平相关的HCC固有异质性对于不同AFP水平HCC的分子机制研究，以及AFP阴性HCC的早期诊断标志物的发现和个性化治疗至关重要。本研究以低与高AFP的HCC肿瘤组织和血清为研究对象，利用完整N-糖肽从头测序的方法，整合蛋白质组与糖蛋白组研究不同AFP水平的HCC相关位点特异性糖基化的固有异质性。在HCC组织中共鉴定到4700多个完整糖肽，同时在两组HCC肿瘤组织中发现了糖基化共同改变的糖肽。在低与高AFP的HCC患者血清中共鉴定到1626个完整N-糖肽，发现无论低还是高AFP的HCC在位点特异性糖基化水平上的差异均大于蛋白质表达水平的差异。在本研究中我们还结合蛋白质组学和糖蛋白质对不同临床状态的HCC组织和其上皮-间质转化模型中N-连接糖链进行系统地定量分析，通过定量分析发现了15个完整糖肽在单发和多灶型肿瘤中均发生上调，其中有6个完整糖肽包含有1-2个唾液酸或核心岩藻糖；进一步对两种肿瘤的差异性进行分析，发现三个带有末端唾液酸的糖肽仅在多灶型肿瘤中显著上调。在肝细胞癌EMT模型中，通过定量分析发现了四种核心岩藻糖基化修饰的糖肽在EMT转变过程中发生2倍以上上调，其中有两个糖肽来自于FOLR1蛋白；进一步对FOLR1蛋白三个糖基化位点上N-连接糖链进行了详细的定量分析，发现其三个位点上的大部分核心岩藻糖基化修饰均在三种细胞EMT过程中明显上调。最后，通过多种分子生物学方法证实FUT8是HGF/TGF-β1诱导的EMT转变的重要驱动因素，这一研究揭示N-连接糖基化修饰在肝细胞癌发展中的动态变化，并阐明肝细胞癌相关的异常糖基化修饰促进HCC上皮-间质转化的分子机制。本研究对肝癌的发病机理和临床检测研究都具有重要的意义。