基于近同重二甲基标记和同位素轮廓指纹比对的完整N-糖肽定性定量分析研究

Glycosylation is the interaction bridges of cell-cell, cell-protein, and cell-lipid. Aberrant regulation of glycosylation is closely related to cancers and many other diseases. Qualitative and quantitative analysis of differentially expressed glycoproteins under disease conditions will facilitate early detection of diseases, discovery of drug targets, development of drugs and monitoring of drug efficacy. So far, tremendous progresses have been made in chemical derivatization, enrichment, liquid chromatography-tandem mass spectrometric analysis of N-glycans, glycosite-containing peptides, and intact N-glycopeptides; single N-glycoproteins and some simple N-glycoproteins can now be routinely analyzed. However, high-accuracy and high-throughput analysis of unknown complex N-glycoprotein mixtures still face enormous challenges, such as construction of comprehensive theoretical databases of intact N-glycopeptides, high-accuracy and high-throughput bioinformatics analysis of liquid chromatography-tandem mass spectrometric datasets, high-accuracy quantitative analysis at the intact N-glycopeptide level, etc. Based on previous research on bioinformatics and quantitative analysis of intact proteins and peptides, this proposal is to carry out research on qualitative and quantitative analysis of intact N-glycopeptides using isotopic envelope fingerprinting, pseudo-isobaric dimethyl labeling, and hepatocellular cancer cell HepG2 (vs. normal LO2) as model system.

糖基化修饰是细胞-细胞、细胞-蛋白及细胞-脂类相互作用的桥梁；其异常调控与癌症及其他诸多疾病密切相关。疾病条件下差异表达糖蛋白的定性定量分析有助于疾病早诊断、药物靶标发现、药物开发及疗效跟踪。基于质谱的糖蛋白质组学目前是糖蛋白分析的重要手段。到目前为止，N-多糖、含糖基化位点多肽及完整N-糖肽的化学衍生、富集、液-质联用分析等已取得了巨大的进展；单个糖蛋白及一些简单的糖蛋白混合物已经能够被例行地分析；然而，未知复杂糖蛋白混合物的高精度高通量分析仍然面临诸多挑战；比如，理论完整N-糖肽数据库的全面构建、液-质联用分析数据组的高准确度高通量生物信息学解析、完整N-糖肽水平上的高准确度定量分析等。本项目拟以肝癌细胞HepG2(LO2为对照)为模式体系，以申请人前期在完整蛋白质及多肽定量分析及质谱数据解析方面的工作为基础，研究基于近同重二甲基标记和同位素轮廓指纹比对的完整N-糖肽定性定量分析。

N-糖基化是蛋白质上常见的翻译后修饰，人体中50%以上的蛋白质是糖蛋白；糖蛋白的功能与N-糖基化的位点和结构（单糖组成、序列结构、链接异构、异头异构）一一对应；目前常见的蛋白质类疾病标志物、药物靶点以及大分子药物等大部分都是糖蛋白。在本项目的支持下，申请人将N-糖基化的鉴定从组成层次提高到了结构层次，同时发展了基于同位素标记的相对定量分析方法。主要研究内容包括：1）新技术新方法研发方面，发展了同位素二乙基标记相对定量方法；发展了完整N-糖肽RPLC-HILIC二维高效液相色谱分离方法；优化了完整N-糖肽高能碰撞诱导解离的阶梯能量；对N-连接糖高能碰撞诱导解离的解离通道进行了全面探索；研发了结构特异定量N-连接糖搜索引擎GlySeeker；研发了位点和结构特异定量完整N-糖肽数据库搜索引擎GPSeeker。2）在N-连接糖的水平上，基于所发展的结构特异定量N-糖组学，对人肝模式细胞LO2上的N-连接糖组进行了全面定性鉴定；对人肝癌模式细胞HepG2（相对于LO2）上差异表达的N-糖基化进行定性定量分析。3）在完整N-糖肽水平上，基于所发展的位点和结构特异定量N-糖蛋白质组学，在临床组织（胰腺癌）、模式细胞（耐药乳腺癌细胞、耐药乳腺癌癌症干细胞、乳腺癌癌症干细胞）以及体液（尿液）等三个层面开展了潜在糖蛋白生物标志物和药物靶点的发现研究。取得的重要结果和关键数据包括：1）二乙基标记实现了50倍线性动态范围定量，RPLC-HILIC实现了唾液酸链接异构体和岩藻糖位置异构体的色谱分离和定性定量，N-连接糖主要解离通道是B/Y/Z 离子（正离子模式）和B/C/Z 离子（负离子模式），GlySeeker和GPSeeker分别能对N-连接糖组和完整N-糖肽组液-质联用分析的数据组进行自动假阳性控制下位点和结构特异定性定量搜索。2）从LO2细胞中鉴定到了214个N-连接糖，从胰腺癌组织中鉴定到了20038个完整N-糖肽和定量到了52个差异表达完整N-糖肽，从耐药乳腺癌细胞、耐药乳腺癌癌症干细胞、乳腺癌癌症干细胞中分别鉴定了322/4016/2558个完整N-糖肽和定量到了20/247/144个差异表达N-糖肽，从人尿液中鉴定到了2986个完整N-糖肽。