金黄色葡萄球菌喹奴普丁-达福普汀耐药新基因lsa(E)水平转移机制研究

Staphylococcus aureus is an important pathogen that can cause a wide variety of hospital- and community-acquired infections. After 2005, livestock associated methicillin-resistant S. aureus (LA-MRSA) was more and more paid attention to. LA-MRSA can also go across the specices barrier to spread to human and even in hospital.This finding also cause cross-resistance to clinic antibiotics by growth promotor antibiotics in animals a matter of concern. Quinupristin/dalfopristin is a new streptogramin antibiotic with a spectrum of activity that includes Gram-positive pathogens, including those resistant to other classes of antimicrobial compounds. Until now this antibiotic wasn't market in China. Based on our previous research, a high resistance rate to quinupristin/dalfopristin was observed in animal isolates with the trend spreading to hospitals because vigimycin was widely used as a growth promotor in China. A new quinupristin/dalfopristin resistance gene lsa(E) was found in 97% resistance isolates with pig origin in northeast China. Lsa(E) maybe originated from enterococcus by horizon gene transfer. In this research work, horizon gene transfer of lsa(E) from enterococcus to different S.aureus lineages by conjugation and transfer of lsa(E) among different S.aureus lineages by phage transduction will be evaluated.This work will provide the theory basis for prevention and control of multiresistant S.aureus isolates and valid usage of growth promotor for animals in China.

金黄色葡萄球菌是医院及社区获得性感染的主要病原菌。2005年家畜相关耐甲氧西林金葡菌被广泛关注，该类菌株可以越过物种屏障，传播到人类，这一发现导致抗生素类动物促生长剂与临床抗生素交叉耐药问题日趋严重。喹奴普丁-达福普汀属于链阳菌素类新型抗生素，该药目前还未在我国上市。但本课题组前期研究发现，由于维吉霉素（同属链阳菌素类）在我国动物饲料添加剂中的使用，导致猪携带菌株对喹奴普丁-达福普汀具有高耐药率，而这种耐药现象似乎已经开始向医院波及。在我国北方，97%的猪耐药菌株携带一个新的耐药基因lsa(E), 该耐药基因可能从肠球菌水平转移而来。本研究欲对lsa(E)水平转移机制进行初步探讨。通过结合转移实验，评价lsa(E)在粪肠球菌与金黄色葡萄球菌间水平转移的可能性；利用噬菌体转导技术，评价lsa(E)在不同金葡菌克隆系间水平转移的可能性，为耐药菌株的预防控制策略和抗生素类促生剂的合理使用提供依据.

金黄色葡萄球菌是一种重要的条件致病菌。在大量抗生素压力下，金黄色葡萄球菌可以很快的出现耐药性。耐药性产生的机制主要包括点突变或者耐药移动原件的水平转移。有研究表明肠球菌和金黄色葡萄球菌可以通过水平转移进行耐药基因的交换。喹奴普丁-达福普汀（QDA）属于链阳菌素类新型抗生素，该药目前还未在我国上市。本课题组前期研究发现，由于维吉霉素（同属链阳菌素类）在我国动物饲料添加剂中的使用，导致我国东北地区22.5%的猪对喹奴普丁-达福普汀耐药，同时携带一个新的耐药基因lsa(E),这些菌株均属于ST9型。基于序列分析，提示lsa(E)可能从肠球菌水平转移到金黄色葡萄球菌。本研究通过对北京临床分离的98株屎肠球菌及83株粪肠球菌进行喹奴普汀-达福普汀耐药基因检测，发现临床分离株屎肠球菌（46/98, 46.9%）主要携带lsa(E), 这些菌株以ST78型为主（36/46，78.4%）。而粪肠球菌（83/83,100%）主要携带lsa(A)。选取lsa(E)阳性，利福平（第二筛选药物）敏感的12株粪肠球菌和9株屎肠球菌作为供体菌株，选取6株不携带质粒的临床分离金黄色葡萄球菌为受体菌。用滤膜结合转移技术平台，进行两两配对，完成结合转移实验。1株屎肠球菌N7435与1株金葡菌R3645产生了携带lsa(E)的结合子。重复三次的转移频率分别为1.125*10-7，0.18*10-7，和0.03*10-7。结合子的QDA MIC值从0.38µg/ml升高到16µg/ml ，增加了42倍。本研究首次在体外证明了lsa(E)基因的跨种可传播性，为lsa(E)基因的起源及可移动性提供了实验证据。本研究通过lsa(E)阳性菌株的基因组测序，发现在3株菌中均存在一个缺陷的IV型限制性修饰系统，该系统的缺陷有可能是导致ST9型菌株易于接受外源移动原件的原因。这一发现从基因组水平进一步阐释了新耐药基因产生的机制。本研究建立了噬菌体转导平台，用转导噬菌体29评价lsa(E) 耐药基因在不同来源（病人，健康人和动物）金黄色葡萄球菌间水平转移的可能性，未获得阳性克隆子。表明转导噬菌体29无法在金黄色葡萄球菌间协助转导lsa(E)。