新基因pbpR负调控金黄色葡萄球菌耐药性的作用与机制研究

耐药性金葡菌(MRSA)是临床感染中重要的超级细菌，其耐药性的快速增长已使MRSA感染濒临无药可治的困境。研究表明：MRSA耐药性与其染色体上整合的耐药岛密切相关，该耐药岛上mecA基因编码的PBP2a分子是MRSA耐药性必须的。通常，mecA的表达在基因水平受着mecR1/mecI的调控，但并不是有PBP2a表达，金葡菌就会表现出耐药性，提示PBP2a功能的发挥还受蛋白水平的调控，而目前对参与这一调控的分子及其机制都不清。我们的前期工作证实MRSA新基因pbpR的编码产物（PBP-R）与PBP2a有相互作用。本课题拟通过平行检测金葡菌中PBP-R与PBP2a的表达，明确两者的相关性；利用基因敲除和过表达技术研究pbpR对MRSA耐药性的负调控作用；通过筛选突变体文库，确定PBP-R与PBP2a作用的关键位点，阐明pbpR负调控MRSA耐药性的机制，为寻找控制MRSA感染的新途径奠定基础。

由mecA基因编码的PBP2a是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的重要耐药决定簇，mecA的表达在基因水平受到mecR1/mecI的严格调控。然而，临床上总能发现少数mecA基因阳性而对苯唑西林敏感的金葡菌，我们前期利用B2H筛选到一个MRSA新基因pbpR编码的产物（PBP-R）与PBP2a有相互作用，提示PBP2a可能还存在蛋白质水平的调控因子。本研究首先对分离自北京、上海、重庆、广州、沈阳、乌鲁木齐的517株金葡菌临床分离株进行分析，发现MRSA 309株，占59.77%；MRSA分子分型研究发现流行于我国的3个主要流行克隆与2种特征性耐药谱相关；在这些MRSA菌株中，发现6株mecA基因阳性，但对苯唑西林敏感的菌株，占1.9%（6/309）。利用qRT-PCR检测6株金葡菌中pbpR基因的表达，发现在接触抗生素的2h pbpR的表达水平最高，随后逐渐下降，这一趋势与pbpR在MRSA标准N315株中的表达趋势一致。通过克隆pbpR全基因，再用B2H方法进行验证，证实PBP-R全蛋白与PBP2a在细菌体内具有相互作用；进一步构建PBP-R的GST融合表达载体，表达和纯化GST-PBP-R蛋白，用pull-down实验再次验证了PBP-R与PBP2a的相互作用。分别构建了pbpR基因敲除株（N315△pbpR）和过表达菌株（N315-pbpR-ov）、dapB基因敲除株（N315△dapB）；利用肉汤稀释法、E-test法和菌群分析法检测了N315△pbpR、N315△dapB、N315N315-pbpR-ov、pLI50空载体转化株（N315-vector）以及N315野生株（N315-wt）对苯唑西林的敏感性，发现在忽略N315异质性耐药的前提下，pbpR敲除后菌株的耐药性增强，过表达pbpR则菌株的耐药性水平下降，表明pbpR对MRSA的耐药性具有负调控作用。进一步通过分子建模，和分子对接研究，发现PBP-R与PBP2a的变构区存在相互作用，在相互作用的9对氨基酸中，将PBP-R的第50-52位氨基酸突变为丙氨酸后，突变体与PBP2a的相互作用下降，揭示了PBP-R与PBP2a的相互作用机制，为寻找新的控制MRSA感染策略奠定了理论基础。发表论文6篇，其中SCI收录期刊论著3篇，参加学术会议及受邀报告6次，培养博士生1名，硕士生3名。