基于3号和21号染色体区域的家族性高胆固醇血症新致病基因发掘与验证

家族性高胆固醇血症（FH）是常见且严重的单基因遗传病。研究证实，临床确诊患者中10-15%检测不到已知6种致病基因突变。为发现FH新致病基因，我们前期在国家自然基金资助下，对一个排除已知基因突变的汉族FH大家系进行全基因组扫描，将候选基因定位于3号和21号染色体两个全新区域。鉴于传统筛选新致病基因方法效率低，最近我们尝试全新、高效的全外显子重测序技术分析先证者及其父母全部外显子，已将上述区域中候选基因数量缩小至23个。本课题提出假说："从该家系3号和21号染色体中能筛选到一个调控肝脏胆固醇代谢关键环节的新致病基因"；拟扩大该FH家系成员样本利用全外显子重测序技术继续发掘，完成新致病基因精确定位并在患者及人群中验证；采用生物信息学方法预测其编码蛋白结构和功能；经典分子生物学方法明确新基因组织分布，围绕胆固醇代谢各关键环节阐明其调控机制，揭示基因型与表型关系，为FH早期诊断和基因治疗提供依据。

本课题组圆满完成课题任务。本课题围绕筛选定位FH新致病基因的关键科学问题，拟在前一国家自然基金工作基础上，聚焦3号和21号染色体两个全新候选区域，采用最新测序技术对该家系深入分析，试图找到新致病基因，为早期诊断早期干预及优生优育提供理论依据。本课题主要研究对象是传统方法未能发现3个主要致病基因突变的特殊家系，采用先进的全外显子捕获重测序技术，对先证者及家系主要成员进行全外显子捕获富集，生物信息学分析拼接、过滤筛选出致病基因，并采用传统测序及cDNA全长测序方法验证，最终明确了目标家系先证者的致病基因突变位点位LDLR第8内含子纯合突变IVS8 [-10]G>A，该突变导致RNA剪切异常，使内含子8个核苷酸插入到RNA，引起开放阅读框移位，致终止密码子提前出现；经家系内部验证突变来自其父母的遗传；为挖掘FH新致病基因，我们准备了5个候选核心家系作为研究对象，他们均未检测到LDLR、apoB及PCSK9三个主要致病基因突变。为克服全基因组测序和全外显子组捕获技术成本高，周期长的缺点。我们依据Nature杂志荟萃分析GWAS研究发表可增加高血脂风险的95个SNPs，自行构建包含上述95个基因靶向外显子捕获芯片结合二代测序技术对5个FH核心家系进行筛查，捕获到多个候选基因，其中可溶性环氧化物酶（EPHX2）基因突变R287Q可能性大。课题组对R287Q在核心家系中进行传统测序验证，构建突变体表达载体转染细胞，结果发现其降低LDLR对LDL结合和内化能力，推测可能通过此途径减少胆固醇排出造成机体内胆固醇堆积，但最终认为该基因可能不一定为FH致病基因；靶向捕获二代测序还在另外30个FH家系筛中筛选到6个LDLR新致病突变位点，为FH遗传学提供了新的数据；通过与安贞医院彩超室、核医学科合作，建立了FH多模态心血管结构功能检测影像学平台，动态监测FH患者心血管结构和功能学特征，为综合评估病情以及最佳治疗方案提供有价值的信息；将课题组采用靶向捕获二代测序捕获到的大量SNPs作为前期研究，申请者获得了新的国家自然科学基金《脂代谢中微效多基因协同作用致遗传性高胆固醇血症的机制研究》资助（No.81471098，起止年份：2015-2018）;培养研究生7人；发表标注本课题基金号的SCI论文6篇(总影响因子25.696，且均为通讯或共同通讯作者)，发表中文核心杂志论文13篇；经费使用合理。