功能SNPs介导的miRNAs网络对家族性高胆固醇血症患者PCSK9-LDLR通路的调控机制

The mutation of LDLR, apoB100 and PCSK9 were known to cuase Familial Hypercholesterolemia (FH), the phenotype of FH homozygotes patients is extremely serious. Recent reported that SNPs increase the level of LDL-c and disturb regulation of miRNAs network. With the support of the former subject of National Nature Science Foundation, we discovered that FH patients with rs12710260 were at higher level of LDL-c, bioinformatics predicted the SNP can produce a new binding site of miR-484 thus increasing the extra binding ability, but the mechanism is not clear. Therefore, we hypothesized that: “SNPs may regulate the PCSK9-LDLR pathway by miRNAs network regulation”. We intend to group these FH homozygous patients who carry the same LDLR gene mutation according to the level of LDL-c. mRNA and miRNAs sequencing , bioinformatics analysis select another 1-2 miRNAs combined with SNP;CRISPR/Cas9 is used in the point mutation of hepatic cells,To explore the regulation of PCSK9-LDLR pathway by gene overexpression and silencing techniques. Thus confirmed in FH patients and build risk assessment model .It is of great significance to provide new FH early warning markers.

已知LDLR、apoB100和PCSK9三种致病基因突变引起家族性高胆固醇血症（FH），纯合患者极其严重。新近报道SNPs升高FH患者LDL-c水平，干扰miRNAs调控。在前一国家自然基金资助下发现携LDLR基因rs12710260 A等位基因患者LDL-c升高，生物信息学预测SNP产生miR-484新位点增加额外结合，但机制不明。故提出 “SNPs借助miRNAs网络调控PCSK9-LDLR通路” 假说。拟对携LDLR基因相同突变的FH纯合患者以LDL-c水平分组，miRNA及mRNA测序、生物信息学分析再选取1-2个与LDLR 基因SNP结合的miRNAs构建网络；CRISPR/Cas9技术建立点突变肝细胞，探讨SNPs变异时miR-484等过表达和沉默对PCSK9-LDLR代谢通路的调控；将SNPs及miRNAs构建新风险预测模型并在FH患者中验证。本项目对FH早期预警意义重大。

截止到目前，已基本完成课题计划的主要研究内容，并取得相应成果。.一、新的发现：首次发现纯合FH患者外周血中显著差异表达2个miRNA(miR-941与miR-486-3p)及4个基因，且这些基因与miRNA通过不同功能参与到患者动脉硬化进展中，提示动脉硬化新的作用机制。首次对121例FH患者的基因组SNPs位点进行功能分析并筛出5个可能引起miRNA表达异常的位点，并正在家系及其他未携带这些位点变异的FH人群中进行进一步验证，后续这些SNP与对应miRNA及下游基因的功能研究在进行中；首次在纯合FH患者血清中进行非靶代谢组学分析，发现关键差异通路Steroid hormone biosynthesis，glycerolipid metabolism, Glycerophospholipid metabolism，并在扩大样本中验证发现胆汁酸谱中的6种胆汁酸亚型的水平与对照相比具有显著差异，提示LDL-C的长期升高已诱发胆汁酸合成的异常，并进一步扰乱其他代谢过程。已建立我国最大的纯合FH家系数据库及样本库，在完善遗传变异的同时发现许多新的位点及新的遗传模式，此外，还从中鉴别诊断出40例的植物固醇血症家系，开启了新的研究方向。.二、发表论文：基于这些研究成果，已发表了4篇SCI文章以及12篇中文期刊文章，此外还有正在撰写、投稿或者返修阶段3篇文章：以本研究核心内容miRNA与转录组共同分析撰写的文章已投稿genomics期刊并修回，代谢组学研究结果及中国纯合FH遗传特点及临床特点的文章正在投稿阶段。.三、人才培养：培养博士生3人（1名已获得博士学位），硕士生3人（3名已获得硕士学位），培养的博士生（江龙）毕业后获得一项国自然青年项目（资助号：81700792）。.四、后续研究：在本研究成果的基础上，2020年本人第二负责人获得一项国自然面上项目（资助号：82070916），研究具有可持续性。.五、潜在应用前景：本研究所发现的纯合FH患者显著差异的2个miRNA及血清中胆汁酸的代谢异常均可为疾病病理进程提供新的解释，并有望作为延缓心血管动脉粥样硬化的关键干预靶点。此外，针对我国纯合FH患者遗传突变的特点，可根据其中高频突变建立更为快速精准的基因筛查工具，并对具有不同遗传突变的患者提供更为个性化的诊疗干预意见。