柯萨奇B3病毒阻滞Hela细胞于G1/S期的分子机制研究

柯萨奇B3病毒（CVB3）可引起病毒性心肌炎，但其致病机制尚未完全阐明。申请人的前期工作发现，CVB3感染同步化细胞后，细胞周期主要停滞在G1/S期，并且利用酵母双杂交技术从人心脏cDNA文库中筛出了与CVB3 VP1相互作用的一种新蛋白- - MAT1。现已知MAT1作为亚单位，与CDK7和Cyclin H共同形成三聚体复合物CAK，且对CAK的活性起着"分子开关"的作用，调控细胞周期由G1期进入S期以及细胞的起始转录。本课题拟在此基础上，深入研究人细胞内VP1和MAT1的直接作用，分析VP1和MAT1相互作用的各自必需区域；进而，采用流式细胞术探讨VP1和MAT1相互作用对细胞周期的影响，利用免疫印迹技术分析VP1和MAT1相互作用对CAK活性和CDK7含量的影响，从而阐明两种蛋白的相互作用与CVB3阻滞Hela细胞于G1/S期的关系，为了解CVB3所致心肌炎中的复杂分子机制奠定基础。

申请人前期发现，CVB3感染导致细胞周期停滞在G1/S期，并且利用酵母双杂交筛出了与CVB3 VP1相互作用的一种新蛋白——MAT1。现已知MAT1作为亚单位，与CDK7和Cyclin H共同形成三聚体复合物CAK，且对CAK的活性起着“分子开关”的作用。本课题在此基础上，为了避免酵母双杂交结果的假阳性,进一步在CVB3病毒感染的Hela细胞中通过激光共聚焦显微镜观察发现：VP1和MAT1在细胞内有相同的空间定位，可同时存在于细胞浆中。这种共定位现象也同样出现在pBudCE4.1-VP1质粒转染的Hela细胞浆中。而且，在CVB3感染的细胞中，采用细胞内免疫共沉淀技术证实VP1与MAT1在细胞内存在相互作用。进而，利用基因突变技术明确了与MAT1相互作用的VP1必需区域为VP1的C端（768-853aa），与VP1相互作用的MAT1必需区域为MAT1的C端（191-309aa）。而文献报道，MAT1 的C端区域（229–309aa）也是其与CDK7/cyclin H 复合物相互作用的必需区域，是CDK7在细胞核中稳定存在并发挥活性的前提。我们的结果提示VP1 和CDK7/cyclin H 亚复合物共同竞争结合MAT1。流式细胞仪分析发现，pBudCE4.1-VP1和pBudCE4.1-VP1-D8（768-853aa）转染组的G1期细胞比例明显高于空质粒转染组 (p<0.05)。另一方面，随着pBudCE4.1-VP1转染时间及CVB3感染的延长，不仅细胞总蛋白中MAT1与CDK7表达量逐渐下调，而且，CAK复合物中CDK7的表达也逐渐地降低，但Cyclin H表达无明显改变。CAK磷酸化功能检测结果显示，不仅CAK的底物RNA Pol II CTD及p-RNA Pol II CTD在各时间点中的表达量逐渐下调，而且磷酸化RNA Pol II CTD表达量占RNA Pol II CTD表达量的比例也逐渐地下降。综上所述，柯萨奇B3病毒阻滞Hela细胞于G1/S期的分子机制可能是VP1，特别是VP1的C端（768-853aa）与MAT1在细胞内的相互作用，使得VP1与CDK7/Cyclin H亚复合物两者分别与MAT1竞争性结合，引起CDK7稳定性下降，导致CAK复合物表达量减少以及活性下降，从而抑制细胞周期由G1期进入S期以及细胞的起始转录。