土家族药接骨膏对骨折愈合过程中BMP、VEGF表达调控的机理研究

Bone paste from the Tujia folk application experience of treating fracture, Clinical application of thirty years, Treatment of closed fracture obtained satisfactory curative effect. Research has shown that,BMP,VEGFare important growth factors in bone tissue formation,BMP has multiple isoforms expression in fracture healing process.The project on the basis of previous studies, through the cultivation of animal experiment in vivo and in vitro BMSCs,The bone paste in promoting fracture healing mechanism might be through Smad pathway activation of BMP positive regulation factor,And activation of OSC, type I collagen, OPN osteogenic gene transcription, or inhibiting and blocking BMP cell suppressor factor and intracellular BMP release, promotes the expression of BMP, VEGF, BMSCs to promote the differentiation of OB,VEGF can promote angiogenesis in bone tissue regeneration,to accelerate the healing of fracture.Using immunohistochemical and real-time fluorescent quantitative PCR method for different periods of BMP-2, 7, 9 and BMPR-IA, B, II gene expression; signal transduction of BMP protein and inhibiting protein gene, osteogenic gene, VEGF expression.To explore the molecular mechanism of bone paste in promoting fracture healing, and provide a theoretical basis for the widely used clinical bone paste and further research and development.

接骨膏来源于土家族民间外敷治疗骨折的经验方，临床应用三十多年来，治疗闭合性骨折取得了满意疗效。BMP、VEGF是形成骨组织的重要生长因子，BMP有多个亚型表达于骨折愈合过程。本项目在前期研究的基础上，通过在体动物实验和体外BMSCs培养，提出接骨膏促进骨折愈合的机理可能是通过BMP的经典Smad信号通路激活正调控因子，激活OSC、I型胶原蛋白等成骨基因转录，或抑制并阻断BMP细胞外抑制因子及胞内BMP抑制因子的释放，促进BMP、VEGF的表达，促进BMSCs向OB分化，VEGF能促进再生骨组织的血管再生，达到促进骨折愈合的作用。用免疫组化、Westen-blot、Real-time PCR检测不同时期BMP-2，7，9和BMPR-IA、B、II基因，BMP信号传导蛋白和抑制蛋白、成骨基因、VEGF的表达。探索接骨膏促进骨折愈合的分子机制，为临床接骨膏的广泛运用及进一步开发研究提供理论依据。

独正岗接骨膏为湖北民族学院附属民大医院于上世纪七十年代初期开发的一种外用膏剂，临床应用40多年以来，治愈了大量骨折、跌打损伤患者，早在1978年曾获得全国卫生医药科技成果奖。而对其研究大多以临床疗效观察为主，内在作用机制的探讨较少。. 主要研究内容为独正岗接骨膏的家兔实验：骨折处DR摄片行影像学观察；组织学观察（对石蜡切片进行HE染色，普通光镜观察骨折愈合情况）。用免疫组化及实时荧光定量PCR（Real-time PCR）法检测不同时间段骨痂中BMP-2，7，9，VEGF和BMPR-IA；IB；II基因表达及BMP信号正调控因子（Smad-1，5， 8；Cbfα1）和抑制蛋白（Chordin；noggin；Smad6；Smurf-1）；VEGF基因表达的影响；用Westen-blot和Real-time PCR法检测ALP、OC、I型胶原蛋白等的表达，用磷酸苯二钠法测定ALP活性。独正岗接骨膏对骨髓间充质干细胞(BMSCs) 成骨活性的影响实验：用MTT检测每个时间段实验组及对照组的BMSCs细胞相对数量；用免疫组化及Real-time PCR法检测各组细胞中BMP-2，7，9和BMPR-IA；IB；II基因表达及BMP信号正调控因子（Smad-1，5， 8；Cbfα1）和抑制蛋白（Chordin；noggin；Smad6；Smurf-1）；VEGF基因表达的影响；用Westen-blot和Real-time PCR法检测ALP、OC、I型胶原蛋白等的表达，用磷酸苯二钠法测定ALP活性。. 实验结果显示独正岗接骨膏可促进患处骨组织及BMSCs中BMP-2，7，9和BMPR-1A、BMPR-1B mRNA、BMPR-1A、BMPR-1B mRNA基因表达，促进BMP信号正调控因子（Smad-1，5， 8；Cbfα1），抑制Chordin；noggin；Smad6；Smurf-1等抑制蛋白的表达，从而促进ALP、OC、I型胶原蛋白等的表达，加速骨组织的再生，还可增加VEGF的表达，促进再生骨组织中的血管再生。. 本项目运用免疫组化、Real-time PCR、Western blot等方法从分子和细胞学水平深入系统研究并揭示接骨膏促进骨折修复的疗效及其物质基础和内在作用机理，为接骨膏在临床更广泛的应用，更深入的开发研究奠定基础。