锌转运体8膜运输参与胰岛素分泌调控的作用机制

Zinc transport 8 (ZnT8) is mainly located in β cell insulin secretory granules membrane and acts as a transport t enrich zinc ions required for normal processing and packing of insulin. Our previous study showed the functional differences among different genotypic ZnT8. And ZnT8 can traffic to cell membrane with insulin secretion. But the mechanism is still unclear. The project is focus on expression and purification the full length ZnT8. Then we will investigate the function difference mechanism using the heterologous cell expression, protein liposomal reconfigurable system, stopped-flow spectroscopy. It will explain the relation of genotype and phenotype. Meanwhile, we will research the relationship between ZnT8 membrane traffic and insulin secretion regulation using stably cell lines, cell sorting and confocal microscope. The specific antibody which target on the out-membrane domain of full length ZnT8 will be prepared. ZnT8 could be a functional marker on β cell and the mechanism of ZnT8 membrane traffic involved in insulin secretion regulation should be explained. The subject will identify a possible marker for functional β cells and provide a new mechanism for insulin secretion regulation.

锌离子转运体8(ZnT8)主要表达在β细胞的胰岛素分泌囊泡膜上，介导Zn2+在胰岛素分泌囊泡中聚集，与胰岛素的储存运输相关。我们前期实验发现不同基因型ZnT8功能有差异，ZnT8随着胰岛素的分泌能运输到细胞膜上，但差异和运输的机制尚不清楚。本课题将首先表达纯化出全长ZnT8蛋白，利用异源表达和脂质体蛋白重构系统、停流光谱法等技术研究基因型差异导致功能差异的机制，随后使用稳定转染、细胞分选、激光共聚焦等手段研究ZnT8膜运输与胰岛素分泌调控的关系，并制备ZnT8膜外表位特异性抗体，研究ZnT8膜运输作为功能性β细胞表面标志参与胰岛素分泌调控的机制。本课题将为功能性β细胞的鉴定提供一个可能的标志物，且胰岛素分泌调控提供一种新的机制。

本项目主要研究了ZnT8参与胰岛素分泌调控的机制，明确不同基因型的ZnT8介导Zn2+转运、聚集的差异，为T2DM的遗传易感性提供实验依据，为胰岛素分泌调控提供新的靶点。在研期间申请者以第一作者/通讯作者发表论文12篇，培养硕士研究生5名。参加国内外学术交流8次(报告2次)。本项目意义在于：(1)利用异源细胞表达和重组蛋白脂质体重构系统研究了ZnT8突变的功能意义，并阐释ZnT8基因突变与T2DM相关性的可能机制(JBC 2016, Dec, 291(53):26950-26957)。(2)使用带标签重组融合蛋白高表达细胞株来研究胰岛素分泌调控与ZnT8 膜运输的相关性，明确ZnT8可作为胰岛素分泌的调控靶点(JBC 2017, Mar, 292(10):4034-4043)。(3)将全长ZnT8蛋白作为抗原，使用杂交瘤技术制备单克隆抗体，基于CRISPR/Cas9基因编辑系统构建INS-1E细胞ZnT8基因敲除稳定株，证明免疫鼠和1型糖尿病患者血清中皆存在2种不同表位的ZnT8自身抗体，为ZnT8作为胰岛细胞表面标记的提供实验依据(JBC 2018 Jan 12;293(2):579-587)。(4)系统总结和阐述了ZnT8的基因功能和免疫学研究，以及锌离子及锌转运在胰腺中的作用及体内平衡调节，为ZnT8的临床转化研究和深入研究提供可拓展方向。(IJE 2019 Feb 2019:1524905和Inflammopharmacology 2019 Jun;27(3):453-464)。