草鱼呼肠孤病毒膜穿透蛋白VP5酰基化修饰的功能研究

为探讨草鱼呼肠孤病毒（GCRV）膜穿透蛋白VP5的酰基化修饰在病毒入侵细胞过程中的分子机制，本研究拟通过对外衣壳VP5膜穿透蛋白进行凝胶分离与质谱分析，精确测定VP5多肽序列及定位N端酰基化修饰位点；利用已制备的VP5与VP7抗体，通过免疫印迹分析，比较GCRV与体外组装的野生型（VP5wtr-GCRV）与突变型（VP5N42Ar-GCRV）重组GCRV颗粒（r-GCRV）蛋白酶敏感性与VP5构象差异，同时检测VP5 N端酰基修饰肽释放；采用分子标记技术，在体外合成荧光标记的酰基化修饰的VP5 N端短肽，用于GCRV 感染性亚病毒颗粒（ISVP）与r-GCRV ISVP感染细胞的促进反应，通过细胞吸附时相动态比较分析，确定酰基化VP5 N端短肽的释放是否与VP5 C端裂解片段的调节相关，以期阐明GCRV 膜穿透蛋白VP5 N端酰基化修饰的功能。

草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus, GCRV）隶属于呼肠孤病毒科水生呼肠孤病毒属，含有分段的双链RNA（double stranded RNA, dsRNA）基因组，是一种由7种结构蛋白组成的双层衣壳的无囊膜病毒，其中外衣壳由VP5和VP7两种蛋白组成，但其感染机制知之甚少。为探讨草鱼呼肠孤病毒（GCRV）膜穿透蛋白VP5的酰基化修饰在病毒入侵细胞过程中的分子机制，本研究对外衣壳VP5膜穿透蛋白进行凝胶分离与质谱分析，精确测定了VP5多肽序列及酰基化修饰位点；基于GCRV颗粒结构特征及实验室已建立的体外重组杆状病毒表达系统，首先在昆虫细胞中获得了外衣壳蛋白VP5和VP7蛋白高效共表达；并通过Native-PAGE与免疫共沉淀分析，证明了外衣壳蛋白VP5和VP7能够分别形成多聚体形式并且二者之间存在很强的相互作用。此外，采用胰蛋白酶消化初步纯化的GCRV，通过氯化铯（CsCl）密度梯度离心纯化，获取得到纯净的GCRV核心。将纯化的病毒核心与杆状病毒表达系统表达的外衣壳蛋白VP5和VP7按照一定的化学计量比进行体外孵育，获得体外组装的重组病毒粒子（Recoated GCRV, R-GCRV）。经电镜观察、SDS-PAGE及Western blot检测等发现, 采用密度梯度离心纯化的R-GCRV具有与野生型病毒粒子（Native GCRV, N-GCRV）相似的形态大小、蛋白组分和分子量等生物学特性；通过空斑测定及NH4Cl阻断实验分析，发现二者具有相似的感染性，提示R-GCRV与N-GCRV具有相同的感染途径。在上述基础上，比较了GCRV与体外组装的野生型（VP5wtr-GCRV）与突变型（VP5N42Ar-GCRV）重组GCRV颗粒（r-GCRV）蛋白酶敏感性与VP5构象差异，同时检测到VP5 N端酰基修饰肽释放；采用分子标记技术，在体外合成荧光标记的酰基化修饰的VP5 N端短肽，进行了GCRV 感染性亚病毒颗粒（ISVP）与r-GCRV ISVP感染细胞的促进反应。荧光显微镜观察及细胞吸附时相动态比较分析表明，酰基化VP5蛋白N端短肽的疏水结构具有明显的细胞膜渗透作用，但其不足以让病毒进入细胞， VP5 C端片段的裂解，对于病毒入侵细胞至关重要。本研究结果为进一步阐明GCRV入侵宿主细胞机制提供了坚实的实验依据。