草鱼呼肠孤病毒受体筛选及其育种潜力评估

Virus receptors are important targets for molecular breeding of disease-resistant traits. Based on the basis of previous research and whole genome sequence of grass carp, according to grass carp reovirus strain GCRV-GD108 which is the representative strain of GCRV genotype II, this project will enrich some candidate receptor proteins in gill and intestine in grass carp using proteomic analysis. Then we will identify GCRV receptor proteins, and to evaluate their breeding potential for disease resistance by in vitro protein-protein interaction, virus blocking binding and in vivo gene editing techniques. This project will provide key target molecules and technical support for the cultivation of superior varieties of hemorrhage-resistant grass carp.

病毒受体是抗病育种的重要靶标分子。基于前期工作基础，本项目将基于草鱼全基因组序列资料，针对II型GCRV代表性毒株GCRV-GD108，采用蛋白质组学分析方法，富集草鱼鳃、肠组织中的候选受体蛋白；通过体外蛋白质相互作用、细胞病毒结合阻断和体内基因编辑等技术手段，鉴定草鱼GCRV受体蛋白，评估其抗病育种潜力，为草鱼抗出血病品种培育提供关键靶标分子和技术支撑。

本项目基于草鱼全基因组序列资料，针对II型GCRV代表性毒株GCRV-GD108，采用蛋白质组学分析方法，富集了草鱼腮、肠组织中的候选受体蛋白库；对其中显著性富集的SRBI和ITGB1等蛋白进行了重点研究。发现草鱼和稀有鮈鲫SRB1基因都可对GCRV感染产生明显的应答反应，但仅稀有鮈鲫的SRB1蛋白与GCRV的VP7之间存在相互作用关系；草鱼ITGB1基因可对草鱼GCRV的感染产生明显的应答反应，ITGB1和网格蛋白介导的内吞作用相关基因AP-2和Clathrin以及凋亡相关基因Caspase-3和Caspase-9在感染后期明显上调；在稀有鮈鲫中敲除ITGB1基因后，ITGB1-/-型稀有鮈鲫具备了一定的抗病性。推测草鱼SRB1在GCRV感染过程中可能并不与病毒颗粒产生直接联系，ITGB1在GCRV感染并诱导草鱼细胞凋亡的过程中发挥重要作用。此外，我们还采用CRISPR/Cas9技术，以含有启动子和编码区保守碱基（TATAWAW和ATG）的两套20 bp序列为随机突变靶位点，在稀有鮈鲫全基因组水平进行随机突变，经过F1-F3代攻毒筛选获得抗病力为38.24%（攻毒存活率）的突变群体。稀有鮈鲫抗性突变体的获得将为草鱼抗病育种研究提供重要模型研究材料。综上所述，本项目已按照计划完成任务书中要求的研究内容，并获得预期研究成果。