GCRV 非结构蛋白NS38协同NS80在宿主细胞中复制的功能研究

NS38 is a nonstructural protein of grass carp reovirus (GCRV), which proposed to possess single-stranded RNA (ssRNA) binding activity. Previous study in our lab showed that NS38 was retained within VIBs by interacting with NS80 protein. In order to find the role of NS38 in GCRV replication and assembly, the immunofluorescence assays and co-immunoprecipitation analysis will be used to identify the co-localizations and interactions between NS38 and viral structural proteins, viral newly synthesized ssRNA or host translation initiation factors in this project. Furthermore, the ultrathin section of electron microscopy, three-dimensional reconstruction technology and immune electron microscopy will be used to analyze the precise site of NS38 localized in NS80 induced VIBs structure and the relationship between VIBs and cell organelles. At last, the replication and assembly of GCRV at mRNA, protein translation and viral infection level will be analyzed when knockdown the expression of NS38 or host translation initiation factors by using RNAi technology. This study will not only reveal the function of NS38 in GCRV replication and assembly, but also will provide a foundational basis for further developing of new antiviral agents and uncovering the pathogenesis of GCRV during infection.

NS38为草鱼呼肠孤病毒（GCRV）基因组编码的非结构蛋白，具有单链RNA（ssRNA）结合特性。在前期已鉴定NS38与包涵体形成蛋白NS80具有相互作用的基础上，为解析NS38在病毒复制与组装中的功能，本研究拟采用免疫荧光与免疫共沉淀等方法鉴定NS38与病毒结构蛋白及ssRNA在感染细胞中的共定位和相互作用，以及与细胞翻译起始因子的互作关系。应用超薄电镜切片与三维重构及免疫电镜技术获取NS38在NS80形成的包涵体中的高分辨率影像及进行结构解析，以确定NS38在包涵体结构中的准确定位及病毒包涵体在感染细胞中的精细结构与分布。利用RNAi技术敲减NS38以及重要宿主细胞翻译起始因子，通过转染与感染分析，在mRNA与蛋白翻译及病毒水平来检测其对GCRV复制与感染性的影响，以揭示NS38在病毒复制和组装中的功能。其研究结果将为发展新的抗病毒复制药物及为揭示GCRV的致病机理提供实验依据。

草鱼呼肠孤病毒为呼肠孤病毒科水生呼肠孤病毒属一重要成员，其病毒核心内含有11条分段的dsRNA基因片段。在前期对GCRVNS80特性与功能及鉴定NS38与NS80互作基础上，为了解该病毒的致病机理，本项目对NS38在复制中的特性进行了深入研究并取得以下有意义结果。通过免疫荧光及免疫共定位分析，鉴定NS38与病毒核衣壳（VP1-VP4、VP6）蛋白在转染与感染的细胞内具有明显的共定位及互作关系。此外，发现NS38与NS80相互作用是通过与ssRNA的互作得以实现的。为进一步对NS38特性与功能进行分析，进行了siRNAs干扰实验，结果显示敲减NS38不仅能有效降低病毒复制效率，而且能明显降低NS80及病毒核衣壳蛋白VP1-VP4及VP6的表达，表明NS38具有协同NS80起始病毒转录与复制的作用。研究还发现NS38与宿主翻译起始因子3亚单位A（eukaryotic translation initiation factor 3 subunit A，eIF3A）在转染细胞中具有明显的共定位与相互作用关系。上述结果提示，NS38可通过与病毒蛋白及细胞因子在包涵体区域的互作参与病毒复制与组装过程。