非水相介质中微生物脂肪酶法高选择性合成1,3-甘油二酯的研究

1,3-甘油二酯是一种健康油脂，它具有降低内脏脂肪、抑制体重增加、减少血脂等多重保健功能。本项目拟从自然界中富含油脂的土壤中采样，然后富集培养、变色圈平板法初筛结合转化液液相色谱精确检测筛选出产高选择性合成1,3-甘油二酯的脂肪酶的微生物。然后结合传统的微生物鉴定法和现代先进的分子生物学鉴定法对筛选到的微生物进行种属鉴定。接着拟利用登高实验和中心组合实验快速有效优化微生物发酵产酶培养条件，实现产酶量比未优化时提高50%以上。最后拟优化有机介质、水活度、底物浓度和底物浓度摩尔比、转速、温度、脂肪酶量等反应参数构建所筛选到的微生物脂肪酶高效率高选择性合成1,3-甘油二酯的非水相催化体系，实现催化合成的甘油二酯中1,3-甘油二酯的含量达70%以上，为其进一步产业化奠定基础。本项目顺利实施将有利于开发出一种绿色经济简单有效的制备1,3-甘油二酯的方法。

1,3-甘油二酯是一种健康油脂，酶法合成1,3-甘油二酯具有产品安全和对环境友好的优点，不过利用全细胞脂肪酶合成的还未见报到。本项目基于全细胞脂肪酶选择性合成1,3-甘油二酯的简单而经济的优点，我们成功的应用其选择性合成了1,3-甘油二酯。.比较了罗丹明平板法、橄榄油乳化法、对硝基苯酚法测脂肪酶水解酶活和对硝基苯酚法测脂肪酶酯合成酶活这四种常用的脂肪酶活力测定方法。结果表明，每种方法有其应用范围。而且，脂肪酶水解酶活力和其合成活力没有对应关系，所以在筛选产脂肪酶微生物时要选择合适的脂肪酶活力测定方法。.通过罗丹明B平板法初筛、对硝基苯酚法测定合成酶活第一次复筛及高效液相色谱法第二次复筛，筛选到一株产高选择性合成1,3-甘油二酯胞内脂肪酶的菌株GZUF36，被鉴定为黑曲霉（CCTCC No. M2012538）。.通过优化培养基提高了GZUF36全细胞脂肪酶甘油解甘油三酯成的1,3-甘油二酯的产率。通过单因素实验、Box-Behnken design、快速登高实验和Box-Behnken design得得到了最佳培养基成分为：葡萄糖1.03%、豆饼粉1.78%和氯化钾0.044%，ZnSO4 0.044%, Na2HPO4, 0.044%，CaCl2 0.044% 和 K2HPO4 0.044%。在此条件下，1,3-甘油二酯产率为26.887%。. 对黑曲霉GZUF36所产脂肪酶甘油解合成1,3-甘油二酯的反应体系进行优化。结果表明：当有机介质为正己烷/叔丁醇（V/V）29:1，水活度为0.427，反应底物摩尔浓度0.02moL/L，甘油与甘油三酯的最佳摩尔比为2:1，最佳加酶量为400mg/5mL，优化后甘油二酯的产率为29.378%，1,3-甘油二酯在甘油二酯中的含量为88.75%。.通过罗丹明B固体平板显色法初筛和橄榄油乳化法测酶活力复筛，筛选到一株酯水解酶活力高的胞外脂肪酶产生菌HF45（GZUF36），并通过单因素试验和正交试验对该菌进行了培养基优化。在最有条件下，脂肪酶最高酶活力达到 17.54 U/mL，且其水解甘油三酯的主要产物为1,3-甘油二酯。.本项目的实施，为1,3-甘油二酯的绿色合成提供了一种简单绿色经济的方法，有利于丰富生物催化的理论和实践内容，而且对于提升我国油脂行业技术原创力和推动其技术升级都具有重要意义。