脂肪酶-MOF微囊的构筑及其非水相催化的分子机制研究

Lipase is one of the most commonly used enzymes in non-aqueous system. It has found wide applications in food, pharmaceutical and oleochemical industries. Nevertheless, presence of organic solvent in non-aqueous system frequently decreases lipase’s catalytic activity and stability; and also alters its catalytic selectivity. Present study aims to design and synthesize lipase-MOF microcapsules with high immobilization efficiency. The effects of lipase-MOF microcapsules’ physicochemical properties and microenvironment on its reaction kinetics will be investigated. In addition, modulation of lipase-MOF microcapsules’ selectivity through reaction conditions will also be evaluated. In present study, lipase-MOF microcapsules are designed to reduce protein unfolding and induce formation of lipase in the open conformation which will increase its catalytic activity and stability. Besides that, shape memory behavior of MOF will endow lipase-MOF microcapsules with tunable pores size which can be used to reversibly modulate its catalytic selectivity. Findings from present study are expected to provide proof of concept and technical guidance for development of immobilized lipase with high catalytic activity and tunable selectivity.

脂肪酶作为非水相催化最常用的酶之一，广泛应用于食品、药品、日用化工等方面；然而非水相体系中的有机溶剂容易降低其催化活性和稳定性，影响其底物选择性。本项目提出利用金属有机骨架化合物（MOF）来构筑具有高固定化效率的脂肪酶-MOF微囊，阐明脂肪酶-MOF微囊的物化性质、几何微环境等因素对固定化酶在非水相体系中反应动力学的影响，揭示反应条件的调控对脂肪酶-MOF微囊底物选择性催化的影响。本项目所构筑的脂肪酶-MOF微囊将最大程度地减少酶蛋白分子三维结构变化，诱导脂肪酶形成打开构象，从而提高其催化活性和稳定性。此外，鉴于MOF材料具有形状记忆功能，本项目所构筑的脂肪酶-MOF微囊可通过反应条件来调控其孔径大小，临时性地增强脂肪酶和不同底物的结合，赋予脂肪酶-MOF微囊新颖的底物可调控选择性催化功能。本项目将为发展具有高催化活性、高稳定性、可调节底物选择性催化的固定化脂肪酶提供理论依据和技术指导。

生物催化剂由于其高效性，催化特异性和环境友好性而受到关注。游离催化剂易受外界环境（温度、pH、有机溶剂、抑制剂等）的影响而失活，酶固定化技术是通过物理或化学方法将游离酶和相应载体结合起来，从而增强酶的稳定性。同时又能将酶与底物分离，达到重复利用，降低成本的目的。本项目利用金属有机骨架化合物[氨改性ZIF-8（An-ZIF-8）、分级有序大孔ZIF-8(MAC-ZIF-8)]来固定化脂肪酶。阐明金属有机骨架化合物载体表面化学、物理特性以及脂肪酶包埋策略对酶构象变化的影响，解析MOF固定化酶在非水相介质中的反应动力学及底物选择性调控，并将MOF固定化酶应用于电化学快速检测食品中的农药残留。所合成的氨改性ZIF-8、分级有序大孔ZIF-8具有良好的结晶度，高BET表面积和高热/化学稳定性，使其适合于酶的固定化。固定化在An-ZIF-8（BCL@An-ZIF-8）和MAC-ZIF-8上的脂肪酶（BCL@MAC-ZIF-8）具有很高的酯水解活性（BCL@An-ZIF-8 = 5.118 U，BCL@MAC-ZIF-8 = 4.3778 U），且可回收再用于后续的酯水解反应。荧光光谱法、圆二色普以及共聚焦显微镜分析显示脂肪酶可以被MAC-ZIF-8的大孔结构很好地包裹，因此能够保留其天然构象从而使其对底物有高的亲和力（低Km值）。本项目使用这两种固定化脂肪酶，发展了BCL@An-ZIF-8/Chitosan/GCE和BCL@MAC-ZIF-8/Chitosan/GCE酶电化学传感器，并首次应用于果蔬中检测甲基对硫磷、除草醚等农药。固定化脂肪酶可催化甲基对硫磷及除草醚的酯水解，生成具有电化学特性的对硝基苯酚，产生电信号。本项目所构筑的酶电化学传感器显示出较宽的线性范围（0-114µM），较低的检测限（0.46µM）和良好的回收率。与传统的检测方法相比，所构筑的生物传感器还具有操作简便，成本低，线性范围更好的优点。