基于细胞表面疏水空间重构的全细胞脂肪酶非水相催化有机合成特性的研究

在非水相全细胞催化中细胞表面疏水性是影响催化效率的关键因素之一。本研究以酵母展示脂肪酶全细胞非水相催化合成糖酯为对象，利用基于生物信息学的蛋白质分子改造技术，重构细胞表面疏水空间，改善全细胞非水相催化的"微环境"及催化合成活力。研究利用细胞表面荧光分析法对全细胞表面疏水空间与结构的分析，对照不同疏水空间结构对全细胞脂肪酶在非水相催化合成糖酯过程中的水活度、反应区域选择性、催化效率及酶稳定性等影响的规律，研究细胞表面结构-非水相催化"微环境"-糖酯合成效率三者之间的关系，探讨细胞表面疏水空间结构对全细胞脂肪酶非水相催化合成影响机制，拓展基于酵母细胞展示的全细胞催化理论的研究。同时借助蛋白质分子改造技术，通过疏水性聚氨基酸连接片断（Linker）的筛选、全细胞催化条件的优化，建立具有自主知识产权的用于高效合成糖酯的全细胞生物催化体系。

在非水相全细胞催化中细胞表面疏水性是影响催化效率的关键因素之一。本研究以酵母展示脂肪酶全细胞非水相催化合成酯为对象，利用基于生物信息学的蛋白质分子改造技术，重构细胞表面疏水空间，改善全细胞非水相催化的“微环境”及催化合成活力。.研究首先对毕赤酵母GS115全基因组及转录组数据中所有蛋白进行分析，预测到50个潜在的GPI型细胞壁蛋白，并进行总亲水性、S/T含量、N/O-糖基化等生物信息学分析，并以脂肪酶CALB作为外源功能蛋白，用50个预测到的GPI型细胞壁蛋白作为锚定蛋白分别构建新的毕赤酵母表面展示体系。通过流式细胞术和Western Blot的检测确证了13个GPI型的细胞壁蛋白，扩展了毕赤酵母表面展示锚定蛋白的范围。CALB水解酶活的检测结果显示这13个新的展示体系的展示酶活力均体现了较高的水平，但不同的展示体系之间也存在较大的差异，其合成活力与GPI细胞壁锚定蛋白的疏水性具有一定的相关。.此外，利用真菌疏水蛋白（Hydrophobin）能在亲水-疏水界面通过自我组装形成一层紧密稳定的约10nm厚的两性蛋白膜的特性，将来源于真菌疏水蛋白HFB1（源于Trichoderma reesei）和SC3( 源于Schizophyllum commune)与CALB脂肪酶共展示在毕赤酵母细胞表面，通过观察CALB脂肪酶活力的变化情况以及菌体的疏水性，以得到疏水蛋白对细胞表面的影响。结果表明：两种疏水蛋白对细胞表面及CALB酶活力的影响存在显著差异，重要的是HFB1疏水蛋白不但增强了细胞表面的疏水性，而且提高了对底物p-NPP（p-nitrophenol palmitate）的水解活力。同样的结果经修饰的毕赤酵母细胞上展示了脂肪酶CALB的全细胞GS115/CALB-GCW21和GS115/CALB-GCW61在正庚烷的有机相中催化合成己酸乙酯的分析中发现，表面疏水性高的细胞均有利于脂类水解及酯的合成。研究还进行了细胞表面疏水性的化学修饰，分别利用甲基咪唑六氟磷酸盐[bmim][PF6] 或添加吐温80修饰细胞表面，发现经过离子液体和吐温80修饰的细胞在乙酸乙烯酯和香叶醇的转酯反应中的活力明显提高，反应8批次后活力基本没有下降。.以上研究结果表明，细胞表面的疏水性的重构有利于疏水性底物与酶的相互作用，从而促进细胞展示脂肪酶的催化作用。