非水相微生物细胞区域选择性催化非天然核苷酯合成及其影响机理的研究

本课题以非水相细胞催化核苷酰化反应合成具有抗癌活性的核苷酯类化合物为研究对象，对比研究不同介质中微生物细胞区域选择性催化非天然核苷酰化反应的特性，阐明在非水介质中不同来源的微生物及其固定化方式对该反应的反应速度、区域选择性及细胞稳定性的影响规律；结合不同介质的性质、不同条件下各菌种细胞的生理生化特性、各物质在反应体系中的分配规律以及与反应相关酶活性的影响之研究，揭示全细胞催化非天然核苷酯类化合物区域选择性合成的机理及各相关因素对该反应影响的机理。本研究不仅将丰富非水相微生物细胞催化反应的理论基础，还开辟了利用全细胞生物催化具有抗癌活性的非天然核苷酯合成的新途径、新方法，并为新型抗癌药物核苷酯类化合物的研制提供新的理论基础和技术支撑。

核苷类似物是一类重要的抗癌化疗剂，但在其临床应用过程中体现出毒副作用高、生物利用率低等缺点。利用前药原理修饰此类核苷类似物可制备具有更高活性的新型抗肿瘤药物，核苷酯类化合物就是此类新药的重要代表之一。目前核苷酯类化合物的合成方法中，酶法较之传统化学法具有反应条件温和、选择性高、环境友好等优点。然而，用离体酶做催化剂成本昂贵，这成为阻碍酶法难以工业化应用的重要原因。基于上述背景，本项目以非水相细胞催化核苷酰化反应合成具有抗癌活性的核苷酯类化合物为研究对象进行了如下研究：. 对不同种类及来源的细菌、霉菌和酵母在催化核苷酰化反应中的活性研究表明，微生物细胞的种类和形式对其催化核苷酰化反应活性具有重要影响。已筛选出一株米曲霉Aspergillus oryzae 3.5232，能选择性催化阿糖胞苷3´-乙酯的合成。以所筛选的真菌米曲霉Aspergillus oryzae （A. oryzae）为主要研究对象， 本研究对比研究了微生物细胞在不同介质体系中催化非天然核苷酰化反应的特性，探讨了反应介质对微生物细胞催化核苷酯合成反应的影响，阐明了在非水介质中不同来源的微生物对该反应特性及细胞稳定性的影响规律；研究确定了反应条件对微生物细胞催化核苷酯合成反应特性的影响规律；并通过对非水介质中全细胞催化剂与微生物源脂肪酶的催化特性的对比研究，深入探讨了反应介质影响全细胞催化核苷酯合成的酶学基础。. 本项目还以A. oryzae为主要研究对象，探讨了培养条件对其催化核苷酰化反应活性的影响规律，确定米曲霉中具有酰化合成活性的酶蛋白受脂质底物诱导；而常规速效碳源葡萄糖和麦芽糖的加入对相关酶合成具有阻遏作用。此外，本研究还探索了具有催化核苷酰化活力的脂肪酶在米曲霉细胞中的定位特性；对米曲霉细胞组分中的目标酶蛋白进行了分离纯化，并对其中具有酰化合成活性的脂肪酶进行了性质鉴定。此外，本项目还对显示高5´-区域选择性的假单胞菌的催化行为进行了初步研究，确定该细菌具有良好的稳定性和催化活性。. 综上，结合介质性质及与反应相关酶活性的影响等系列研究，揭示了全细胞催化非天然核苷酯类化合物区域选择性合成的机理及各相关因素对该反应影响的机理。本项目的研究不仅将丰富微生物细胞催化反应的理论基础，，还开辟了利用全细胞催化具有抗癌活性的核苷酯合成的新途径。