SBK2调控RHOT1介导的线粒体再分布在乳腺癌脑转移过程中的机制研究

Brain metastasis is the most lethal metastatic site in breast cancer patients. According to the bioinformatics analysis, we identified the gene of SBK2 as a candidate gene which involved in the breast cancer occurrence and metastasis to brain. Next, Our group identified that compared with normal breast tissue, the SBK2 expression upregulated in the cancer tissues of breast cancer patients. In addition, SBK2 can phosphorylate serine in the downstream effector RHOT1. Furthermore, the upregulated phosphorylated RHOT1 can upregulate the concertation of RHOT1-activate. In fact, RHOT1 is an important gene to regulate mitochondrial redistribution. Thus, we hypothesized that SBK2 can regulate RHOT1-mediated mitochondrial redistribution thereby promote brain metastases in breast cancer. In this project, we plan to obtain the reliable evidence of the mitochondrial redistribution from RHOT1 mediated by SBK2 to promote brain metastases in breast cancer. By using immunoprecipitation, site mutation, kinase analysis, and analysis of clinical data of breast cancer. Our research will provide a scientific basis for establishment of SBK2 as a new prognostic indicator and a target therapy for breast cancer.

乳腺癌脑转移是晚期乳腺癌最为致死性类型。通过生物信息分析显示SBK2作为调控其侵袭能力的候选基因，其可能在乳腺癌脑转移的发生发展过程中起重要作用。既往研究证实RHOT1是调控线粒体运动的重要基因，通过调控线粒体的再分布能够调控细胞转移及侵袭能力。本课题组在乳腺癌患者的离体标本中发现SBK2表达上调且与差的预后相关，初步验证了该分析结果。我们的研究显示，SBK2通过磷酸化方式作用于其下游效应分子RHOT1上的丝氨酸位点，并能影响RHOT1的激活。由此，我们提出假设：SBK2调控RHOT1介导线粒体再分布促进乳腺癌脑转移的发生。本项目拟采用免疫共沉淀、位点突变、激酶分析等手段以及分析乳腺癌的离体样本蛋白表达情况，获得SBK2调控RHOT1 介导线粒体再分布促进乳腺癌脑转移的可靠证据。为确立SBK2作为乳腺癌预后指标和治疗的新靶点提供科学依据。

乳腺癌脑转移是晚期乳腺癌预后最差的一种类型。目前临床上仍无特异性靶向治疗药物。本课题终点探讨了乳腺癌发生脑转移的潜在分子机制，以期为晚期乳腺癌的治疗提高更多选择。本课题的重要结果及关键如下：1.阐明SBK2在乳腺癌发生脑转移以及与预后的关系。在154例浸润性乳腺癌患者的临床样本中检测并分析SBK2、RHOT1的表达，包括mRNA和蛋白水平的检测。结果显示SBK2、RHOT1高表达乳腺癌人群具有更差的预后（all p < 0.001）。基于这一结论，我们依据SBK2和RHOT1的表达构建联合指标（Combined Marker）。其中SBK2和RHOT1均高表达定义为高风险，BK2和RHOT1均低表达定义为低风险，其余定义为中等风险。ROC曲线显示,相比较与单一指标，联合指标具有更高的曲线下面积（AUC SBK2= 0.73; AUC RHOT1 =0.71; AUC combined =0.78;）。2.阐明SBK2能够调控乳腺癌增殖、迁移以及侵袭能力。通过对稳转录细胞株进行MTT, 划痕试验检测不同SBK2表达情况下乳腺癌细胞的增殖和迁移能力；采用共培养的方式建立内皮细胞/星形胶质细胞共培养模型，用于模拟正常血脑屏障，分别加入上述不同稳定细胞株，比较不同SBK2表达水平下的乳腺癌细胞侵袭能力，结果显示SBK2能显著上调乳腺癌细胞株的侵袭能力。3.阐明SBK2-RHOT1-线粒体功能调控体系在乳腺癌发展中的机制问题。结果WB试验，我们发现SBK2和RHOT1在体内具有直接结合。并且能够上调RHOT1的激活状态，RHOT1的激活进而可以提高细胞体内线粒体的裂变状态。随后，通过使用GPS 3.0，我们预测并证实了SBK2能够磷酸化RHOT1-183S位点。通过使用放射菌酮干扰核糖体功能后，我们发现SBK2能够通过磷酸化RHOT1-183S，进而降低RHOT1的泛素化水平，显著延长了RHOT1在体内的半衰期（7.4hours versus 4.3 hours）。综合上述3个重要结论，我们完整的阐明了SBK2在乳腺癌脑转移过程中的机制问题，为后续设计靶向药物提供理论基础。