BK通道α亚基羧基末端调节血肿瘤屏障通透性作用机制的研究

血肿瘤屏障(BTB)极大限制了脑肿瘤的药物治疗。BK通道在脑肿瘤血管内皮细胞和脑肿瘤组织中高表达，能选择性增加BTB通透性。我们的前期工作初步证明BK通道α亚基C端(A775-L1178)在BTB通透性调节中起重要作用，但机制不清。本项目首先研究α亚基C端 (A775- L1178)不同截短突变体对BTB通透性的影响，明确调节BTB通透性的功能肽段Cx。进一步分析α亚基C端功能肽段Cx与caveolin-1、ZO-1、actin、MAGI-1等蛋白的相互作用，以及对信号分子p42/p44 MAPK和eNOS的调节作用，阐明α亚基的C端功能肽段调节BTB通透性的分子机制。最后，表达并纯化调节BTB通透性的功能肽段Cx的融合蛋白，研究该融合蛋白对化疗药物转运效果的影响。本项目通过深入研究BK通道α亚基C端功能肽段调节BTB通透性的分子机制，为脑肿瘤等中枢神经系统疾病的治疗和药物研发提供新途径。

血肿瘤屏障很大程度上限制了化疗药物到达脑肿瘤。本研究中，我们研究在人脑微血管内皮细胞(human brain microvascular endothelial cells, HBMECs)中，人Slo1alpha亚基C末端(C-terminus of alpha subunit of human Slo1,hSlo1c)是否与Cav-1具有相互作用以及二者相互作用对血肿瘤屏障通透性的影响。首先，以重组hSlo1c质粒,pCMV-hSlo1c (aa775–1178)转染HBMECs，免疫共沉淀提示hSlo1c与Cav-1具有相互作用，激光共聚焦显微镜结果显示hSlo1c与Cav-1共表达。进一步构建不同长度的hSlo1alpha亚基C末端截短体，以人恶性胶质母细胞瘤细胞(U87 MG)和HBMECs共培养构建体外血肿瘤屏障模型，在HBMECs中表达上述截短体后加入NS1619，免疫共沉淀结果提示aa966-1022可能是hSlo1c与Cav-1相互作用的重要功能片段。与pCMV-hSlo1c (aa775–966)组相比，其他表达aa966-1022片段的截短体组在NS1619作用后，HRP跨内皮细胞转运显著增强。采用小凹结构破坏剂filipin(Ⅲ)或以pCMV-ΔhSlo1c (aa966-1022 deleted)转染HBMECs，均能显著抑制HRP跨内皮细胞转运的增加，提示hSlo1c与Cav-1相互作用可增强血肿瘤屏障通透性，破坏二者相互作用则能够抑制血肿瘤通透性的增加。最后，通过免疫荧光法和流式细胞术检测，我们发现，与转染pCMV-hSlo1c (aa775–1178)组相比，去除hSlo1C末端的aa966-1022片段，促使Cav-1由胞浆向细胞膜转移，提示hSlo1c可能通过改变Cav-1在胞浆与细胞膜上的分布参与跨内皮细胞转运的调节。