核糖体蛋白S16突变提高淀粉酶产色链霉菌合成丰加霉素的机制研究

Toyocamycin is a nucleoside antibiotic, which has important application value due to its broad-spectrum and high-efficiency biological activity. The production of toyocamycin could be significantly improved by ribosome engineering, but the mechanism of regulating toyocamycin pathway is still unclear. Therefore, to explain the mechanism of activating toyocamycin pathway, the mutant in ribosomal protein S16 (coded by rpsP) was considered with ppGpp synthase, regarding the ribosome as regulatory elements. The ppGpp synthase was activated by S16 mutation and ppGpp was used as a key compound to connect “S16 mutant-ppGpp-toy cluster” pathway. Three key procedures were explained by biochemistry and molecular biology methods, including the activation of ppGpp synthase by S16, the relationship between S16 and ppGpp accumulation, and the transcriptional regulation of toy cluster. Overall, the research would expose the regulation mechanism of toyocamycin in S. diastatochromogenes by S16, which provides a theoretical basis for the activation of secondary metabolism using ribosomal engineering techniques.

丰加霉素是一种核苷类抗生素，因其广谱高效的生物活性而具有重要应用价值。研究表明采用核糖体工程策略可大幅度提高淀粉酶产色链霉菌1628的丰加霉素产量，但是核糖体突变激活丰加霉素途径的机制仍不明晰。本项目以前期筛选获得的一株核糖体S16蛋白突变（由rpsP编码）的丰加霉素高产菌株为研究对象，围绕“核糖体蛋白S16突变是如何激活丰加霉素合成途径”这一科学问题，提出核糖体作为调控元件的概念，将S16突变与ppGpp合成酶激活作用相结合，利用全局调控因子ppGpp作为关键节点物质，打通“S16突变-ppGpp-丰加霉素途径”通路。运用生化与分子生物学等手段，阐释S16突变对ppGpp合成酶激活作用、S16突变与胞内ppGpp积累关系、ppGpp通过转录调控丰加霉素基因簇三个关键步骤，解析核糖体S16蛋白突变提高淀粉酶产色链霉菌1628合成丰加霉素的机制，为应用核糖体工程技术激活次级代谢奠定理论基础。

丰加霉素是一种核苷类抗生素，因其广谱高效的生物活性而具有重要应用价值。研究表明采用核糖体工程策略可大幅度提高淀粉酶产色链霉菌1628的丰加霉素产量，但是核糖体突变激活丰加霉素途径的机制仍不明晰。本项目以前期筛选获得的一株核糖体S16蛋白突变（由rpsP编码）的丰加霉素高产菌株为研究对象，探究S16蛋白突变激活丰加霉素合成途径的调控机制。（1）以S16突变核糖体相结合的ppGpp合成水解酶（RSH）为出发点，通过基因组挖掘和序列比对获得淀粉酶产色链霉菌中RSH基因，并对RSH蛋白的结构域功能区进行初步分析；异源表达和纯化RSH蛋白，发现无核糖体作用下，RSH蛋白主要发挥水解功能；在核糖体存在时，S16蛋白突变核糖体对RSH合成催化效率相对野生型提高23.5%，说明S16蛋白突变能够更有效的激活RSH合成活性。（2）进一步研究发现S16蛋白突变株在1~4天内积累更多的ppGpp，并且S16菌落形态更加致密，蛋白表达谱与野生菌也存在差异，说明ppGpp在S16突变株中发挥重要生理功能。进一步构建ppGpp0菌株，发现ppGpp0菌株转录、翻译、细胞分裂过程相关基因表达量更高，在营养充足条件下菌体生长速度更快。ppGpp也会影响碳源和氮源的利用以及抗生素抗性。转录组分析发现ppGpp造成嘌呤代谢途径17个基因的差异表达，能够减少嘌呤代谢流向GTP合成与积累，证实S16突变导致的ppGpp积累能够改变菌体的生理生化特性。（3）ppGpp作为严谨反应信号分子，多在营养匮乏的应激状态下产生，研究发现营养匮乏条件能够在对数前期、对数后期和稳定期激活淀粉酶产色链霉菌内toy基因簇基因的表达，说明ppGpp与丰加霉素合成途径密切相关。随后发现在ppGpp+菌株内PtoyA启动子启动效率提高110.3%，结合toy基因簇转录水平更高，说明ppGpp能够激活丰加霉素合成途径。为进一步证实ppGpp的功能，构建ppGpp高积累菌株，丰加霉素产量从154.28 mg/L提高到3459.74 mg/L。因此本项目揭示了S16蛋白突变导致ppGpp积累造成的菌体生理生化特性改变，以及ppGpp对丰加霉素的转录激活作用，为揭示链霉菌中次级代谢调控机制提供理论基础。