红松松塔抗肝癌活性多糖PKP-Ⅱa一级结构的研究

松塔(pine cone)系松属植物的球果，其水溶性多糖具有抗肿瘤、抑菌等生物活性，但决定松塔多糖功能的一级结构尚不清楚，这大大制约了松塔多糖生物活性、理化性质等基础性的研究。申请者前期研究发现：红松松塔粗多糖脱蛋白、脱色后，经纤维素层析和凝胶色谱分离得到的松塔多糖PKP-Ⅱa具有明显的抗肝癌活性，并由阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成的一种还原性多糖，分子量65000 D。本课题在此基础上，利用特异性糖苷酶切技术结合红外光谱、高场及超导核磁、气相色谱-质谱联用等现代仪器分析手段，系统研究红松松塔多糖PKP-Ⅱa的一级结构，从而获得四种单糖间的排列顺序、相邻糖基的连接方式、糖的端基构型以及糖链有无分支、分支位点等结构信息，为抗肝癌药物的研发及红松松塔的资源利用提供科学依据。本项目选题具有创新意义，研究成果将对我国多糖资源产业化开发应用以及多糖研究领域学术水平的提高具有重要意义。

本研究以林产废弃物-松塔为研究对象，开展松塔中水溶性多糖的基础性研究。采用化学法和层析法，从红松松塔水提物中共分离得到五个新的单一多糖组分，命名为PKP-IIa, PKP-E-1-1, -1-2, -2-1和-2-2。运用化学法、色谱法、光谱法及核磁共振波谱技术对这五个单一多糖组分的纯度、单糖组成、糖苷键类型、连接方式等结构信息进行表征。同时对这五种多糖的抗氧化活性及PKP-IIa诱导肝癌细胞凋亡机理进行了研究。研究结果显示：（1）PKP-IIa 由L-阿拉伯糖，D-甘露糖，D-葡萄糖和D-半乳糖四种单糖组成，高碘酸氧化-Smith降解结果表明PKP-IIa中主要存在1→2或1→2,6或1→4或1→4,6位连接的糖苷键，1H NMR和13C NMR谱图表明该多糖组分包含α-和β-两种糖苷键类型，含有三种异头碳类型，推断为→4)-α-D-GalpA-(1→、→6)-α-D-Galp-(1→和→4)-α-D-Glcp-(1→；（2）PKP-E-1-1, -1-2, -2-1和-2-2这四种多糖主要由L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-甘露糖、D-葡萄糖和D-半乳糖五种单糖组成，均为α-吡喃糖，不含核酸和蛋白质，不具有三股螺旋结构，含有一定的-O-连接，主要由1→6或1→糖苷键链接，根据一维和二维核磁共振波谱技术推断四种多糖可能存在的糖苷键类型有α-L-Ara-(1→、→2,6)-β-D-Man-(1→、→4)-β-D-Glcp-(1→和→6)-α-D-GalpA-(1→；（3）PKP-IIa作用人肝癌细胞HepG2后，凋亡相关蛋白bax和Rb蛋白的表达为上调，能引起人肝癌细胞HepG2 中DNA的合成能力下降，从而诱导人肝癌细胞的凋亡，抑制肝癌细胞的增殖；（4）五个单一多糖均具有较好的羟基自由基和ABTS自由基清除能力。上述工作系统研究了松塔活性多糖的化学结构和生物活性，为松塔的开发利用、变废为宝提供了科学依据。目前，发表学术论文10篇，其中SCI收录3篇，申请专利3项，培养硕士生5人，已毕业4人。