脂筏标志蛋白FLOT1在肺腺癌转移中的作用及分子机制研究

Our previous plasma membrane proteome analysis of human lung adenocarcinoma (AdC) suggests that up-regulation of Flotillin-1（FLOT1） was significantly correlated with lymph node metastasis of lung AdC. In order to eluciadate the roles and mechanisms of Flotillin-1 in lung AdC, in this project we will firstly establish human AdC cell line with expressional downregulation, and investigate the effects of Flotillin-1 downregulation on the in vitro and in vivo invasive and metastatic ability of lung AdC cells, as well as on the activity of EGFR/PI3K/AKT/FOXO3a signal pathway in human lung AdC cells. Furthermore, we will isolate and identify the interacting proteins of Flotillin-1 in lung AdC cells using targeted proteomics, and confirm the Flotillin-1 interacting proteins using Co-IP combined with western blot and immunofluorescent double labeling combined with laser confocal microscope technology. Finally, we will reveal the biological significance of Flotillin-1 interacting proteins, and descover networks and signal pathways of Flotillin-1 interacting proteins by bioinformatics, and find interacting protein network and signal pathways. The expected results not only are helpful to elucidate the roles and mechanisms of Flotillin-1 in human AdC metastasis, but also can provide candidate target for predicing AdC metastasis and targeted therapy.

申请人前期肺腺癌膜蛋白质组研究发现：脂筏标志蛋白Flotillin-1(FLOT1) 高表达与肺腺癌转移相关。为揭示FLOT1在肺腺癌转移中的作用及其分子机制，项目首先建立FLOT1表达下调的肺腺癌细胞系，分析FLOT1表达下调对肺腺癌细胞体外和体内侵袭转移能力的影响；探讨FLOT1表达改变对EGFR/PI3K/AKT/FOXO3a信号通路活性的影响及其与肺腺癌转移的关系；最后采用靶向蛋白质组学分离鉴定肺腺癌细胞中FLOT1的互作蛋白，免疫共沉淀-Western blot以及免疫荧光双标记激光共聚焦技术等验证FLOT1的互作蛋白，并采用生物信息学解析其生物学意义，以发现FLOT1的相互作用蛋白网络和涉及的信号通路。项目研究成果不仅有助于揭示FLOT1促进肺腺癌转移的作用及其分子机制，而且能为肺腺癌转移预警和靶向治疗提供靶标。

近年来AdC的发病率呈逐步上升，且患者预后差、死亡率高，严重威胁我国人民的健康和生命。绝大多数AdC易发生早期转移，癌细胞转移已成为了影响AdC患者预后的关键因素。AdC转移是一个多基因参与的过程，多个基因之间通过相互作用形成关键性的节点，这些节点在AdC转移中具有重要作用。我们前期实验采用蛋白质组学方法筛选AdC质膜组织差异表达的蛋白质，鉴定了36个差异质膜蛋白质，采用Western blot和免疫组化学染色检测差异蛋白质FLOT1在癌旁正常肺组织、AdC组织以及有淋巴结转移AdC组织的表达情况。结果发现：FLOT1表达水平与AdC转移、临床分期以及预后密切相关，提示FLOT1表达升高在AdC转移中可能具有重要作用。. 为此，我们采用靶向蛋白质组学方法(免疫共沉淀结合质谱分析)分离鉴定AdC细胞中FLOT1的相互作用蛋白，通过基因本体论(GO)、功能聚类、信号通路和蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction, PPI)等生物信息学方法分析FLOT1的相互作用蛋白，揭示其生物学意义，并对关键相互作用蛋白进行实验验证和功能研究。主要结果如下：1、采用靶向蛋白质组学在细胞中鉴定出1080个FLOT1的相互作用蛋白，这些蛋白有已经报道FLOT1发生相互作用的蛋白，如FGR，CD44，CAV1，ITAV 等， 2、GO和聚类分析：1080个FLOT1的相互作用蛋白可聚类成208个功能相关的簇，这些蛋白的功能主要归类为16个方面，3、KEGG和Biocarta信号通路分析：FLOT1的相互作用蛋白涉及28 条Biocarta信号通路和62条KEGG信号通路，其中15个蛋白质相互作用涉及到蛋白质泛素化泛素化途径，11个相互作用蛋白涉及到PI3K/EGFR信号通路，8个相互作用蛋白涉及到NF-kappaB信号通路。PIP分析显示：与FLOT1的直接作用的蛋白质大多数参与PI3K/EGFR或NF-kappaB信号传导通路。结果提示：FLOT1表达上调可能通过调节PI3K/EGFR信号通路和NF-kappaB信号通路促进肺腺癌侵袭转移。