华细辛质量指标成分含量动态变化规律及其与生源相关性的研究：基于黄樟醚生物合成途径的解析

Methyleugenol and safrole are two principle chemical constituents of Radix et Rhizoma Asari, with the former acting as the most important bioactive substance and the latter contrarily as toxic substance. They alternatively occupy the highest level of content in essential oil. Therefore, either methyleugenol or safrole is regarded as quality evaluation index of Radix et Rhizoma Asari in spite of their opposite evaluation significance. It is also known that the chemical structures of methyleugenol and safrole are very similar because they commonly possess the 1-allyl benzene bone and two methoxy or methylenedioxy functional groups at 3,4 positions of benzene ring, indicating that they are probably derivatives of some kind of dihydric phenols which are stemmed from a common metabolic intermediate. It means that the biosynthesis pathways of methyleugenol and safrole should be closely related so that they could be synchronously regulated up or down, giving rise to the increase or decrease in content of methyleugenol and safrole. In the present proposal, several populations of Asarum sieboldii representing various geographical sites will be taken as experimental samples to detect contents of methyleugenol and safrole, leading to make clear the spatial and temporal variation rules of A. sieboldii chemical quality. Furthermore, the gene expression levels involved in methyleugenol biosynthesis will be quantitatively analyzed by qRT-PCR approach to demonstrate the spatial and temporal variation patterns in transcription level; and with the help of 13C stable isotope tracing technology, safrole biosynthesis pathway will be investigated and consequently the relationship between methyleugenol and safrole in biosynthetic process could be analyzed. The results would provide not only scientific data for correctly understanding the variation mechanism of A. sieboldii quality, but also technique guide for particular control and improvement of the quality through secondary metabolic engineering. To elucidate the completely novel biosynthesis pathway of safrole underlies the innovation point of the proposal.

甲基丁香酚和黄樟醚分别是中药细辛的主要有效成分和主要毒性成分，也是含量最高的两个成分，代表细辛质量评价正向和反向意义两向指标。甲基丁香酚和黄樟醚的化学结构近似，都是1-烯丙基苯在苯环3,4位具二元酚结构的衍生物；同时在细辛中，两者含量高低的对比存在逆转现象，均提示甲基丁香酚和黄樟醚的生物合成途径可能具有密切相关性。本项目拟选取华细辛有地理代表性的种群为样本，比较不同地点、不同生长阶段的样本中甲基丁香酚和黄樟醚的含量，揭示华细辛化学品质的时空变异规律；进而，利用qRT-PCR技术，分析甲基丁香酚生物合成途径酶基因表达水平的时空变异模式；利用13C稳定同位素示踪技术，解析黄樟醚生物合成途径，探讨甲基丁香酚和黄樟醚的生源相关性。研究结果可为阐明华细辛质量变异规律及其机制提供基础资料，为次生代谢工程定向控制细辛质量提供指导，具有重要的理论和实践意义。对黄樟醚生物合成途径的解析是本项目的创新点。

本项目以解析黄樟醚生物合成途径及其与甲基丁香酚生物合成相关性为主要研究内容，综合利用13C稳定同位素标记示踪技术、基因表达特性分析检测技术，以及基因功能研究技术等研究手段，揭示细辛黄樟醚与甲基丁香酚含量变化的规律及其分子机制。通过本项目的研究，初步建立了13C稳定同位素标记示踪技术在药用植物活性成分生物合成途径解析上应用的技术体系，包括前体物喂饲方法和目标化合物检测方法；构建了华细辛不同发育阶段不同组织器官的转录组数据库，获得了黄樟醚与甲基丁香酚生物合成途径相关酶基因表达水平的变化模式，结合黄樟醚与甲基丁香酚含量检测，建立了黄樟醚和甲基丁香酚含量变化与生物合成相关基因表达之间的联系，根据研究结果，华细辛根中黄樟醚和甲基丁香酚的含量存在逆向变化格局，且该变化格局与CYP719A基因的表达水平的变化高度一致，即CYP719A基因表达量高时，黄樟醚含量上升，甲基丁香酚含量下降，反之，CYP719A基因表达量低时，黄樟醚含量下降，甲基丁香酚含量上升；克隆了CCoAOMT、CCR、CAD、IGS、CYP719A、CPR等多个黄樟醚与甲基丁香酚生物合成途径相关的酶基因，通过酶促催化反应和转基因植物的表型检测，证实了它们的功能，为黄樟醚生物合成途径的解析提供了分子依据。在已有研究工作的基础上，提出了黄樟醚生物合成途径的假说；黄樟醚与甲基丁香酚的生物合成途径基本一致，两者的次生代谢分流点在途径的最后一步，即它们均以丁香酚为生物合成的共同底物，由CYP719A催化生成黄樟醚，而由EOMT催化生成甲基丁香酚。由于CYP719A基因与EOMT基因分别处在两个并行的代谢支路上，它们在功能上的拮抗效应是黄樟醚与甲基丁香酚含量逆向变化的分子基础。本项目研究结果初步解析了黄樟醚的生物合成途径，为后续完全揭示细辛主要有效成分甲基丁香酚与主要毒性成分黄樟醚含量变化的相关性及其分子调控机制提供了重要的研究基础。