冻干红细胞残余水的性质及其对红细胞冻干保存的影响

Freeze drying is one of the most important approaches for long term storage of red blood cells. In the dry state, there is still some water left in red blood cells. It is usually believed that the water should be as less as possible. But in views of cell metabolism, the left water is essential for alive cells and it must remain at a certain level. At present, it is widely believed that the amount of water left inside cells should be at 5 percent around. Considering that this number is obtained for the case of freeze drying both food and drugs, we propose that the amount of residual water necessary for alive cells should be studied, including their distribution inside cells. In the proposal, we will also conduct research on the effect of the left water on rehydration and metabolism of dried cells. The obtained results will lay foundation for optimizing the procedure for freeze drying erythrocytes and even the presevation of blood for clinic use.

红细胞的冻干长期保存是输血医学中的重要研究课题，是有效解决血液供应紧张的方法之一。研究发现，冻干红细胞内总有一定的残留水难以去除。一般认为，这部分水应该尽量地少，以降低细胞的新陈代谢率，延长细胞的保存期；但也有人提出这部分水可能是结构水，它与周边细胞结构的分子作用力使得它的去除较自由水更难，如果强行去除会导致细胞的不可逆破坏。残余水的相关问题是目前红细胞冻干保存研究遇到的最大争议和瓶颈之一。针对这一情况本课题拟开展以下基础性研究：1）建立残余水的测定方法；2）研究残余水的性质、分布及与周边膜结构的关系；3）研究残余水含量与冻干条件和细胞代谢的关系；4）验证和分析"海藻糖的水替代机制"。研究旨在发现残余水对于冻干红细胞的生物学活性以及细胞寿命的关系，建立一套红细胞冻干保存的残余水量与功能的实验模型，明确红细胞冻干保存所需的最低残余水量，为优化红细胞干燥保存程序提供实验和理论依据。

红细胞是重要的医疗资源，但常规4°C保存有效期短，深低温保存储存成本高、操作繁琐。冻干保存具有成本低、运输方便等优势，可能成为最有效、经济的红细胞长期保存方法。然而，在冻干保存过程中，红细胞需经受复杂的物理化学过程，易造成严重细胞损伤。研究表明，残余水含量对冻干红细胞具有重要意义。因此，残余水相关问题是红细胞冻干保存重要研究方向。.主要研究内容及结果如下：.1.红细胞冻干残余水份测定方法。通过比较热重法、Karl-Fisher法、KF联合卡式炉法、核磁共振法，发现KF联合卡式炉法更适用于冻干红细胞残余水测定。.2.红细胞冻干过程数值仿真方法。基于热力学和传热传质学理论及有限元方法，进行理论建模和数值仿真，建立了红细胞冻干保存的“冻结-解析-升华”模型，分析了冻干真空度，物料体积及隔板温度对冻干时间和残余水含量的影响。.3.红细胞冻干残余水性质。通过控制冻干真空度、隔板温度及冻干时间，建立残余水含量为2.8%~12.45%六个梯度的冻干红细胞组。发现随着保存时间延长，六组ATP含量及SOD活力尚无统计学差异，认为残余水不参与红细胞代谢，另外残余水含量过低影响冻干保存。.4.红细胞冻干残余水分布。在同一条件下，冻干等量不添加保护剂血影细胞、不添加保护剂红细胞、添加保护剂血影细胞及添加保护剂红细胞，比较残余水含量，初步判定残余水位于细胞膜。.5.红细胞冻干保存方法优化。研究不同搁板温度、干燥时间与保存效果之间关系，并探讨最适甘油浓度，发现冻干保护剂最适甘油浓度为（9~15）%（w/v），最适搁板温度为-60℃，次级干燥时间为2h。.6.红细胞冻干保存中海藻糖水替代机制。通过制备含不同海藻糖浓度冻干红细胞，随着海藻糖浓度上升，红细胞复水回收率上升，残余水含量下降，结合上述实验结果，可初步判定海藻糖的水替代机制成立。.本研究中最适保护剂配方以及冻干程序不仅提高冻干红细胞回收率，而且有效节约能源。本研究得出残余水不参与代谢，并初步认为残余水分布于细胞膜，为后续冻干红研究提供科学思路。