华细辛甲基丁香酚生物合成途径及其分子调控机制的研究

Methyleugenol is not only one of the major bioactive compounds but also the index of quality evaluation and control of Asari Radix et Rhizoma. It has been known that the content of methyleugenol varies hugely among crud drugs of Asari Radix et Rhizoma which are obtained from different sources, giving rise to serious influence on safety and effectiveness of the herb medicine utilization. However, the knowledge about the biosynthesis pathway of methyleugenol remains largely unknown so that it is hard to make scientific and rational explanation to the process and principle of content variation of methyleugenol in Asari Radix et Rhizoma. In the present proposal, Asarum sieboldii Miq., one of the representative plants of Asari Radix et Rhizoma, will be employed as the host organism to be fed with the stable isotope 13C-labelled precursors including 13C-Phe, 13C-ferulic acid and 13C-coniferyl alchol, respectively. Then, metabolites will be analyzed with GC/MS and NMR approaches to distinguish the 13C-labelled components. With the chemical structures comparason and subsequently the lineages tracing between the labeled components, the biosynthesis pathway of methyleugenol in A. sieboldii is aimed to be elucidated. Moreover, on the basis of cDNA library construction, ESTs bioinformatics analysis and gene function annotation, candidate genes encoding reductase relevant to the secondary metabolism could be figured out. The full length cDNA of these candidate genes will be cloned through nest PCR and RACE PCR successively. Continually, gene function will be clarified and molecular regulation mechanism of methyleugenol biosynthesis will be investigated. The result of this research will help to completely reveal the biosynthesis pathway of methyleugenol of A. sieboldii, providing the critical theoretic basis for quality evaluation and qualigy control, genetic improvement, and resource utilization and protection of A. sieboldii.

甲基丁香酚是中药细辛主要有效成分和质量评价与控制指标成分。不同产地细辛药材的甲基丁香酚含量差异显著，严重影响用药安全性和有效性。然而，目前对于细辛甲基丁香酚的生源途径尚不清楚，无法从根本上对细辛药材甲基丁香酚含量变异规律做出科学合理的诠释。本项目拟以华细辛为材料，通过13C稳定同位素标记的前体物喂饲，利用GC/MS和NMR检测具13C标记的代谢产物，比较它们的结构特征，追踪它们之间的衍生关系，阐明甲基丁香酚生物合成途径。在此基础上，通过cDNA文库构建、ESTs生物信息学分析和基因功能注释，筛选与次生代谢途径相关的还原酶基因EST，通过巢式PCR和RACE扩增，克隆相关酶基因并进行功能验证，探索甲基丁香酚生物合成过程的分子调控机制。本研究结果将完整揭示细辛甲基丁香酚的生源途径，为细辛质量评价和控制、细辛种质遗传改良、细辛资源合理开发利用和资源保护提供关键理论基础，具有重要的理论和实际意义。

甲基丁香酚是中药细辛的主要活性成分，其含量是细辛药材品质的核心评价指标。目前，甲基丁香酚的生物合成途径基本明确，但调控机制的研究尚属空白。基于此，本项目首先从甲基丁香酚生物合成途径相关酶基因的克隆入手，进而对成功获得克隆的酶基因进行功能验证，分析基因表达与甲基丁香酚含量变化的相互关系，以期逐步阐明甲基丁香酚生物合成的分子调控机制。通过本项目研究，分离了甲基丁香酚生物合成相关的PAL、CCoAOMT、CCR、CAD四个酶基因的cDNA全长，它们与相应的基因序列的相似性均在80%以上；原核诱导表达了CCoAOMT蛋白，该蛋白由249个氨基酸组成，分子量28KD，无跨膜信号，为酸性、可溶性、不稳定、非分泌型蛋白，具有植物氧甲基转移酶普遍存在的A、B、C 3个保守基序和CCoAOMTs特有的D、E、F、G、H 5个保守基序，体外反应可催化咖啡酰辅酶A生成阿魏酰辅酶A，最适反应温度为35℃，最适反应pH为8.5，米氏常数为12μM，最大速率常数为23nM•s-1；原核诱导表达了CAD蛋白，该蛋白由356个氨基酸组成，分子量38.3KD，为酸性、亲水、稳定、非分泌型蛋白质，具有典型的醇脱氢酶超家族保守结构域，在拟南芥中的过量表达促进了主茎木质素含量增加2.96%（增幅达到32.74%），整株植物木质素含量则提高3.20%（增幅达到38.60%）；构建了华细辛盛花期根与根茎的转录组测序数据库，花前期、盛花期和花后期叶的转录组测序数据库；筛选出18S rRNA为华细辛基因表达分析的适宜内参基因；PAL、C4H、COMT、4CL、CCR、CAD的表达呈现一致的变化规律，即在根、根茎、叶片、叶柄和花中均有表达，但地下部分（根与根茎）的表达量高于地上部分（叶片、叶柄、花）的表达量，而在相同组织中，表达量则呈现出营养生长期＜花期＜花后期的趋势，并与甲基丁香酚含量变化同步；叶柄是华细辛诱导愈伤组织最适外植体，适宜的生长调节剂组合为1.5mg/L6-BA和0.1mg/LNAA。本项目研究结果将为华细辛甲基丁香酚生物合成分子调控机制的解析，以及构建基因工程操作平台，实现药材品质的定向改良，提供研究基础，具有重要的理论和实际意义。