基于NSP4/cAMP-PKA 信号通路/AQPs研究葛根芩连方抗RV感染性腹泻的作用机制

目前水通道蛋白（AQPs）在轮状病毒（RV）感染性腹泻中的作用机制尚不清楚。前期研究发现葛根芩连方具有抗RV的作用，可下调RV感染乳鼠大肠AQP4高表达。鉴于RV非结构白蛋白（NSP4）在RV腹泻发生过程中的重要作用，拟制备重组融合蛋白GST- NSP4T，建立RV及NSP4感染乳鼠动物模型和Caco-2细胞模型，研究RV与NSP4诱导肠道8种AQPs的整体表达变化及通过cAMP-PKA信号通路调控AQPs活性的机制；结合质粒载体介导的短发夹RNA (shRNA)、高效液相色谱等多种技术，建立稳定转染shAQPs的Caco-2细胞单层测定AQPs功能的新方法，评价RV与NSP4对AQPs功能的影响及意义；同时进行葛根芩连方干预对比研究，揭示该方通过此途径抗RV感染性腹泻的机制。该研究将为AQPs 作为RV致泻新靶点提供可靠证据，为葛根芩连方应用于抗RV感染性腹泻提供充分的科学依据。

轮状病毒(RV)是引起因幼儿腹泻的主要病原体，国内外对水通道蛋白（AQPs）表达变化与多种病因引发的腹泻相关性进行了深入的研究,但AQPs是否与RV感染性腹泻相关及作用机制尚不清楚。本课题主要研究AQPs在RV腹泻中的作用及机理，探讨葛根芩连方调控肠道AQPs抗RV腹泻的分子机制。完成的工作按任务书计划进行，基本阐明了在RV感染乳鼠动物模型和Caco-2细胞模型上AQPs的整体表达特征及通过cAMP-PKA信号通路调控AQPs活性的机制，明确了葛根芩连方及所含染料木素的干预作用与相关机制，达到了预期研究目标。重要结果：1.阐明了RV感染条件下水通道蛋白AQPs的表达变化特征及相关机制。采用RV-Wa 与RV-SA-11两种毒株，建立RV感染Caco-2细胞模型，系统检测了AQP-1、AQP-3、AQP-4、AQP8的蛋白及mRNA表达的变化，发现AQP-4的表达变化与RV相关，其机理可能为抑制CREB磷酸化从而引起AQP4表达异常。2.建立了RV感染乳鼠动物模型，明确葛根芩连汤可以调节感染乳鼠动物模型大肠AQP-4及钠离子葡萄糖联合转运子（SLC5A1）mRNA的异常表达。3.研究了葛根芩连方抗RV的作用及机制：采用Caco-2细胞模型，该方可用抑制RV复制，可以调节AQP-4的蛋白及mRNA表达变化，并呈一定的时间关系，但对AQP-1，AQP-3， AQP8的表达作用不明显，其机制与激活蛋白激酶A（PKA）的活性，引起CREB磷酸化有关。4.研究了方中所含染料木素抗RV的作用及机制：染料木素能有效抑制轮状病毒在宿主细胞内的复制扩增，并呈现出一定的剂量-效应关系；能抑制病毒mRNA转录和病毒结构蛋白VP-6的合成，抑制胞内外RV抗原及RV病毒颗粒的释放；可上调RV感染过程中低表达的AQP4，此效应呈现出一定的时间剂量关系,其机理可能与提高AC和PKA的活性，同时引起CREB蛋白的磷酸化有关，从而表明染料木素上调AQP4的表达是通过AC/PKA/CREB信号通路。以上研究结果证明AQP4可作为RV感染的新靶点，同时为葛根芩连方抗RV感染性腹泻的临床应用提供依据。