葛根芩连方/Genistein通过Ca2+介导的IP3-DAG-PKC和CaMKII通路调控RV感染性腹泻中NHEs的机制

The mammalian Sodium hydrogen transfer proteins (NHEs) exert the importance on regulating water and sodium metabolism,but the function and mechanism of intestinal NHEs in diarrhea during rotavirus (RV) infection still remain unclear. Our previous work indicated that Gegen Qinlian Formula (GGQL) had potential activity to against rotavirus, which could also down-regulation the mRNA expression of NHE-1, NHE-6 in Caco-2 cells. Herein, we will prepare the recombinant fusion protein GST-NSP4T, then suckling mice or Caco-2 cells will be inoculated with the rotavirus or GST-NSP4T. In this project, we will investigate the expressions of some intestinal NHEs induced by RV and GST-NSP4T in suckling mice or Caco-2 cells. The stable transfection with short hairpin RNA (shRNA) mediated NHEs of Caco-2 cell monolayer will be use for determining the the functions of relevant NHEs, including water and sodium metabolis using HPLC and positron nuclide 22Na technique, and demonstrate GGQL/Genistein will through Ca+ - phospholipid - dependent protein kinase and CaMKII signaling pathways to regulate the NHEs activity. Our research will support NHEs as a new target in RV-induced diarrhea, and will provide adequate scientific basis for GGQL/Genistein used in anti-RV infectious diarrhea.

钠氢转运子（NHEs）在调节水钠吸收等多方面具有重要作用。前期研究发现葛根芩连方具有抗RV腹泻的作用，所含染料木素体外可干扰RV生物合成，该方可下调RV感染Caco-2细胞NHE1,6mRNA表达。目前NHEs在RV感染性腹泻中的作用与机制尚不清楚。基于此，拟建立RV及RV非结构白蛋白4感染乳鼠和Caco-2细胞模型，系统研究9种NHEs在肠道的分布及表达变化；制备稳定转染shNHEs的Transwell模型，并结合高效液相色谱、正电子核素22Na测定等技术，建立同时定量检测水钠吸收的方法，评价相关NHEs的功能；揭示通过Ca2+介导的IP3/DAG-PKC和CaMKII途径调控NHEs活性的机制；同时进行葛根芩连方及染料木素干预对比研究，阐明该方通过此途径抗RV感染性腹泻的机制及物质基础。该研究将为NHEs作为RV致泻新靶点提供可靠证据，为该方应用于抗RV感染性腹泻提供充分科学依据。

轮状病毒(Rotavirus，RV)是导致婴幼儿腹泻的主要病原体，全球每年约有1.1亿人发生感染，死亡人数约20万。目前临床缺乏特效药物，RV疫苗价格昂贵，预防范围有限，如何防治RV感染是重大的难题。.本课题主要采用RV感染细胞模型和动物模型研究了RV对NHEs的表达和调控机制的影响。乳鼠实验结果表明，1.SA-11株RV能够感染四天龄的昆明乳鼠并导致其腹泻，病程至少可以维持四天，腹泻率、腹泻程度与病毒剂量有关。2. 葛根芩连芳（GGQL）对感染RV的乳鼠腹泻有一定的预防和治疗作用，可以减低乳鼠腹泻率和腹泻程度。3. GGQL可以有效地清除乳鼠体内的轮状病毒抗原，也可以减少RV导致的乳鼠肠道细胞凋亡和空泡化现象。4. 模型组可以降低NHE1、NHE2、NHE3和NHE8的mRNA和蛋白在肠道的表达水平，各给药组可以不同程度上调它们的mRNA和蛋白在肠道的表达水平，提示我们NHE1、NHE2、NHE3和NHE8可能与RV感染的作用有关。.细胞实验结果表明，1.来源于人的RV-Wa株病毒可以下调人结肠癌Caco-2细胞中NHE1，NHE6，NHE7和NHE8的mRNA表达，但是来源于猴的SA-11株RV对这四个NHEs的mRNA表达却没有表现出下调的作用。说明不同种属来源的RV对NHEs的影响不一样。 2.RV-Wa的感染使到Caco-2细胞中NHE1和NHE6的表达下调，但对NHE8的蛋白表达并没明显差异。因此我们推测NHE1和NHE6可以作为RV感染的作用靶点之一。3. 染料木素可以上调RV-Wa感染Caco-2后的NHE1和NHE6的mRNA水平；但是对NHE1和NHE6的蛋白表达并无明显的上调作用，说明染料木素对NHE1和NHE6的调控可能是发生在转录水平上。4. RV-Wa感染后可以下调CaM和CaMKII的蛋白水平表达，因此我们推测RV可能是通过Ca2+/CaM/CaMKII通路对NHE1和NHE6进行调控作用。.该课题主要针对NHEs 与RV诱导的感染性腹泻水钠吸收失调的相关性为基点进行了研究，从新的角度揭示了RV腹泻发生水钠吸收异常的机制并寻找到新的诊断和药物作用靶点，其中肠道NHE1和NHE6的功能以及RV对其调控作用是下一步研究重点，也可为临床治疗RV提供潜在的治疗靶标。