长链非编码RNA—LOCCS对结肠癌干细胞分化的调控机制

肿瘤干细胞的增殖和分化是造成肿瘤治疗失败的主要原因。在一些长链非编码RNA(1ong noncoding RNA，lncRNA)内含多种miRNA的互补序列，能通过与miRNA结合的方式对其表达和活性进行调节，从而对基因进行转录后调控。肿瘤干细胞中存在特异性的lncRNA，它们是保持干细胞特性和诱导分化的关键分子。但是lncRNA对肿瘤干细胞分化的调控机制尚不清楚。本研究选用结肠癌干细胞作为研究对象，以前期筛选出的lncRNA-LOCCS分子为主线，采用报告基因、表达质粒、RNA干扰等方法作为主要研究手段，了解在结肠癌干细胞向结肠癌细胞分化过程中，LOCCS分子对于miR-93表达和活性的影响；同时观察其下游受调节基因HDAC8、TLE4表达的变化，探讨LOCCS在人结肠癌干细胞定向分化中的作用，试图进一步阐明肿瘤的发生机制，并为结肠癌干细胞标志物的选择及其根除治疗做些探索性的工作。

本课题组在前期实验中比较了结肠癌细胞株(SW1116)和结肠癌干细胞株（SW1116csc）miRNA表达谱的差异，其中miR-93的表达具有显著差异，miR-93能抑制SW1116csc细胞增殖和集落形成。为探索miR-93的上游调节分子及其作用机制，我们在SW1116csc细胞内筛选出一条含有miR-93互补序列的lncRNA，作为下一步实验的研究对象，并将其命名为LOCCS（lncRNA overexpressed in colon cancer stem cells）。首先我们从结肠癌细胞SW1116中分离结肠癌干细胞SW1116csc并传代培养；根据LOCCS的序列设计并合成siRNA，构建和转导pENTR/U6-siLOCCS质粒，定量PCR法检测pENTR/U6-siLOCCS转导SW1116csc细胞后miR-93表达水平的改变；然后合成miR-93序列，构建和转导pGL3M-miR-93荧光素酶报告载体；再采用全基因合成方法合成LOCCS序列，构建和转导pcDNA-LOCCS质粒，应用双荧光素酶报告分析系统检测内源性和外源性LOCCS分子对pGL3M-miR-93的抑制作用；最后，在上调或下调LOCCS的过程中，采用定量PCR法和Western blot法检测HDAC8、TLE4、CD133、CD29、Stratifin和Musashi-1表达水平的变化，同时检测SW1116csc细胞生长曲线和集落形成率的改变。研究结果显示：pENTR/U6-siLOCCS质粒经测序鉴定能成功表达siRNA，定量PCR法检测pENTR/U6-siLOCCS转导后的SW1116csc细胞，其miR-93表达水平明显升高。pGL3M-miR-93质粒经测序鉴定能成功表达miR-93，应用双荧光素酶报告分析系统检测发现内源性和外源性LOCCS分子对pGL3M-miR-93具有明显抑制作用。我们还观察到细胞内的LOCCS水平与细胞增殖和集落形成率呈正相关。本研究证实了LOCCS在SW1116csc细胞内具有“miRNA海绵”作用，能够吸附miR-93，降低miR-93的表达水平，在miR-93的上游对其起到调控作用。LOCCS促进细胞增殖和集落形成，与miR-93的作用正好相反。