长链非编码RNA对乳腺癌干细胞分化的调控研究

Breast cancer stem cells (BCSC) are thought to be the source of tumorigenesis，development, recurrence and metastasis. Studies have shown that long non-coding RNAs (lncRNA) has a potential role in the control of gene expression and regulation, but the function and mechanism of the action of lncRNA in differentiatin of BCSC are still not known. In this project, we will take the BCSC as object, which will be isolated from MCF-7、MDA-MB-231 cell lines and primary culture breast cancer cells , and lncRNAs expressing in BCSC and non-BCSC will be examined by using lncRNAs chips and sequencing, then analyze the data with biological information technology methods to predict the targeted transcriptional factors and functional analysis of the classic lncRNA will use GFP-lv-SiRNA and lncRNA Mimics to transfect BCSC, key regulatory factors in transcriptional pathways, the effects on BCSC self-renew, proliferation, differentiation, oncogenicity and the modulation mechanisms will be explored. Further significance in clinical work will also be testified, so as to to provide the basis for treatment strategies targeted breast cancer stem cells.

乳腺癌干细胞（BCSC）是乳腺癌发生、发展、复发和转移的根源，长链非编码RNA具有调控基因功能，其对BCSC分化的调控作用目前尚未见报道。本课题拟以MCF-7、MDA-MB-231和原代乳腺癌细胞来源的BCSC为研究对象，以长链非编码RNA乳腺癌干细胞基因调控网络为切入点；拟运用lncRNA芯片结合测序分析技术进行乳腺癌干细胞与非干细胞性癌细胞的lncRNA表达谱的差异性比对分析，通过生物信息技术进行可能作用靶点功能预测，并以GFP-慢病毒-SiRNA和lncRNA Mimics转染BCSC敲除或过表达lncRNA，探索其基因调控网络的内在关联及其在BCSC维持自我更新、增殖、分化、致瘤性和肿瘤复发转移的调控功能，并进一步临床验证其相关性，以期为探索乳腺癌干细胞的靶向治疗提供依据。

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，乳腺癌干细胞（BCSC）是乳腺癌发生、发展、复发和转移的根源，长链非编码RNA具有调控基因功能，其对BCSC分化的调控作用目前尚未见报道。本课题以MCF-7、MDA-MB-231和原代乳腺癌细胞来源的BCSC为研究对象，以长链非编码RNA乳腺癌干细胞基因调控网络为切入点；通过微球体培养与细胞表面的标志CD44+/CD24-流式分选干细胞，原代乳腺癌细胞、MCF-7细胞能够形成微球体，微球体及CD44+/CD24-细胞高表达干细胞相关基因，对多种化疗药物耐药，具有干细胞特征。运用Affymetrix Exon Array_Gminix lncRNA-WT v1.0芯片进行乳腺癌干细胞与非干细胞性癌细胞的LncRNA表达谱的差异性比对分析，获得3倍及以上差异上调表达LncRNA共计41个；获得下调的LncRNA共计25个，利用KEGG数据库对该群基因进行信号通路分析发现，上调差异基因参与的显著性信号转导通路包括RNA转运和真核细胞的核糖体合成等；下调差异基因参与的显著性信号转导通路包括肿瘤中的转录失调和青春晚期糖尿病发生。GO Analysis方法提示上调差异基因的显著性功能分析结果包括有转录和转率调节以及DNA依赖；下调差异基因的显著性功能分析结果包括有RNA聚合酶II启动子的转录调节等。结合差异mRNA和显著性信号通路结果中的差异mRNA交集与差异lncRNA的共表达调控网络，筛选出LncRNA进一步分析验证，证实BCSC中存在9个上调lncRNA（LINC00665, THAP9-AS1, NUTM2A-AS1, LINC01184, LINC01257, RAB11B-AS1, GLIDR, PVT1 和INHBA-AS1），和1个下调的lncRNA（CUEDC），qRT-PCR分析发现，在MCF-7微球体中，以上9个lncRNA表达上调和CUEDC下调；靶向CUEDC的SiRNA转染MCF-7细胞使其功能缺失后，干细胞因子sox2、nanog表达上调，克隆形成试验提示克隆形成能力明显增强，提示干细胞特性增强，通过生物信息技术利用公共数据分析发现高表达LncRNA CORTP及RBL9的乳腺癌患者具有相对较好的预后，为乳腺癌干细胞靶向治疗策略提供依据。