人源抗CAGE单链抗体修饰rMETase隐形纳米粒靶向治疗胃癌的实验研究

和正常细胞相比，大多数肿瘤细胞表现出对外源性甲硫氨酸绝对的依赖。限制肿瘤细胞获得甲硫氨酸可以导致肿瘤细胞发生细胞周期阻滞和凋亡，因此，甲硫氨酸依赖性可以成为胃癌生物治疗的新靶点。重组甲硫氨酸酶（rMETase）是一种可以裂解甲硫氨酸的磷酸吡哆醛依赖性酶。如果能够将该酶导入肿瘤细胞内，就有可能通过干扰胃癌细胞的营养代谢来诱导胃癌细胞发生周期阻滞及凋亡，达到治疗肿瘤的目的。本课题拟将人源抗CAGE 单链抗体（ScFv）修饰的隐形纳米粒作为新型的药物载体，以甲硫氨酸依赖性作为胃癌治疗的靶点，制备应用于胃癌分子靶向治疗的人源抗CAGE ScFv-rMETase隐形纳米粒，通过裸鼠胃癌模型，观察其体内的组织分布和抗肿瘤作用，探索人源抗CAGE ScFv修饰的rMETase隐形纳米粒双重靶向治疗胃癌的应用价值和抗肿瘤机制，为构建新型、高效、低毒的胃癌分子靶向治疗药物提供理论指导和实验依据。

肿瘤细胞甲硫氨酸代谢过程与正常细胞存在明显差异，表现为肿瘤细胞在甲硫氨酸缺乏的体外或体内环境中增殖明显抑制，即肿瘤细胞具有甲硫氨酸依赖性。诸多体内外的研究表明，重组甲硫氨酸酶（rMETase）是一种有效的，广谱的抗肿瘤制剂，其通过分解甲硫氨酸，限制肿瘤细胞获得甲硫氨酸来发挥作用。本研究首先抽取10名胃癌患者血样，进行血淋巴细胞的分离和总RNA的提取。然后通过PCR技术扩增人全套重链可变区基因和轻链可变区基因并对它们进行拼接，构建胃癌人源单链抗体库。本研究所构建的人源单链抗体库容量为7.4×1013。我们选取肿瘤相关基因(cancer associated gene，CAGE)表达蛋白作为目标抗原对单链抗体库进行核糖体展示筛选研究。经过三轮筛选，我们成功地获得anti-CAGE单链抗体基因。随后经双酶切技术将anti-CAGE单链抗体基因连入表达载体并转化E.coliBL21进行表达。在LB培养基中37℃培养12小时，经IPTG诱导表达6小时，收获菌体，经SDS-PAGE分析，anti-CAGE单链抗体的分子质量为35.1kDa，经亲和层析法纯化的anti-CAGE单链抗体的亲和常数为1.3×109L/mol，抗体效价为1:3200。在进一步的研究中，我们以rMETase为模型药物, 成功制备了anti-CAGE单链抗体修饰的纳米隐形阳离子脂质体（anti-CAGE-rMETase –SCLs）用于胃癌的靶向治疗。体外实验表明：和游离的rMETase及单纯的携带有rMETase的纳米隐形阳离子脂质体相比，anti-CAGE-rMETase –SCLs 抑制胃癌SGC-7901细胞生长的效应尤为明显。MTT法检测结果显示：anti-CAGE-rMETase -SCLs对胃癌细胞具有强烈的杀伤活性。Hoechest染色及流式细胞仪检测显示：anti-CAGE-rMETase -SCLs可以诱导胃癌细胞凋亡。在裸鼠皮下移植胃癌模型中检测anti-CAGE-rMETase -SCLs的体内抗肿瘤活性，观察肿瘤体积和裸鼠体重变化。实验结果表明：anti-CAGE-rMETase -SCLs对裸鼠移植瘤生长有明显抑制作用。本课题探索针对肿瘤细胞营养代谢特征设计的分子靶向治疗的应用价值，为新型靶向载体药物的研制提供新的思路。..