基于甲硫氨酸依赖探讨人源anti-CD44- scFv介导的rMETase/5-Fu双药纳米粒靶向杀伤胃癌干细胞研究

To clear cancer stem cells is the key of preventing tumor recurrence and/or transfer.Our previous studies show that recombinant methioninase can effectively interference methionine metabolism of gastric cancer cells and inhibit gastric cancer cell proliferation and induce its apoptosis. But biological effect of rMETase to gastric cancer stem cell is not clear. A new study has found that demethylation regulation can restrain TFAP2E expression, increasing anti-tumor effect of 5-Fu. We hypothesized that rMETase has collaborative antitumor effect with 5-Fu because of its effect of demethylation. Based on this new idea, the project construct human anti- CD44-scFv- rMETase / 5-Fu complex nanoparticles targeting gastric cancer stem cell in the basis of successfully constructing nanoparticles.Then we evaluate the influence of anti- CD44-scfv- rMETase / 5-Fu complex nanoparticles to the gastric cancer stem cell in ability of self-renewal or tumorigenicity or cell cycle regulation or apoptosis in vitro and in vivo and explore the molecular mechanism. The results has important theoretical significance and potential clinical application prospect. At the same time, it will be provide new ideas for targeted therapy of gastric cancer.

清除或抑制肿瘤干细胞是防止肿瘤复发/或转移的关键。我们的前期研究表明；重组甲硫氨酸酶（rMETase）可以有效干扰胃癌细胞的甲硫氨酸代谢，抑制胃癌细胞的增殖，诱发其凋亡。但rMETase对胃癌干细胞生物效应如何尚不清楚。最新研究发现，去甲基化调控可以抑制氟尿嘧啶类耐药基因TFAP2E表达，增加5-Fu 的抗肿瘤效果。我们推测：具有去甲基化作用的rMETase与5-Fu联合具有协同抗肿瘤效应。基于此新设想，本项目在前期成功构建纳米载体的基础上，构建具有主动靶向胃癌干细胞的人源anti-CD44单链抗体介导的rMETase/5-Fu双药隐形纳米粒子, 采用体外培养以及体内实验方法，评估其对胃癌干细胞自我更新、致瘤能力、细胞周期调控及凋亡的影响并探索分子机制。所得的结果将为胃癌的靶向治疗提供新的思路和切入点，具有重要的理论意义和潜在的临床应用前景。

胃癌无法根治的原因是由于胃癌干细胞（GCSCs）的存在,有效清除胃癌干细胞对于获得理想的抗癌疗效是十分必要的。前期研究表明，胃癌细胞对甲硫氨酸具有明显依赖性, 能够干扰甲硫氨酸代谢的重组甲硫氨酸酶（rMETase）具有化疗增敏作用。本课题首先利用肿瘤球培养法和免疫磁珠法分别从胃癌细胞株和胃癌病人血清中成功分离GCSCs，并鉴定其干细胞特性；继而以rMETase为干预手段，研究其对GCSCs “干性”特征及肿瘤干性基因表达的影响；最后制备靶向性较好的HA-rMETase/5-Fu 双药纳米粒，对其治疗胃癌的效应进行体内外生物学评价。相关研究结果如下: （1）通过无血清培养基悬浮培养法，成功分离胃癌干细胞；通过限制性稀释分析胃癌悬浮细胞球形成、二代胃癌悬浮细胞球形成分析、软琼脂集落形成实验证实该肿瘤球具有较强的自我更新能力；通过流式细胞仪检测悬浮细胞球肿瘤干细胞表面标记CD44，结果表明CD44+细胞达到85.93%；从20例胃腺癌临床病人的外周血中，成功在13人（65%）的外周血中分离得到CD133+/CD44+细胞，其中9例（69.2%）病人分选得到的CD133+/CD44+细胞培养成球，培养传代后的细胞依旧明显表达CD133 和CD44 抗原。（2）rMETase干预后胃癌悬浮细胞球个数明显降低，胃癌干细胞中S期细胞比例明显增高，进入G2期的细胞比例显著降低，凋亡细胞数明显增加；胃癌干细胞给予rMETase处理后，肿瘤干性基因Oct4、Nanog、bmi-1和ttf-1均表现出下调趋势，同时， PI3/Akt/mTOR通路中Akt、m-TOR、PI3K信号分子的表达下调。（3）成功制备靶向性HA-PEG-PLGA METase/5-Fu 双药纳米粒；体外细胞实验显示，rMETase 和5-Fu 共同装载在HA修饰的隐形纳米粒中能够达到微观水平上的共同、序贯、协同的作用，显著提高了清除胃癌干细胞的效果；体外动物实验显示HA-PEG-PLGA METase/5-Fu纳米粒能够抑制胃癌的生长并且明显减少了CD44表达阳性的肿瘤干细胞。本课题明确了该靶向纳米载药系统在胃癌靶向与药物协同抗肿瘤治疗中的价值与优势，为我国研制具有自主知识产权的新型智能型靶向协同纳米药物及向临床应用过渡提供了科学依据。