基于CRISPR/Cas9的番茄广谱抗双生病毒育种的研究

Tomato is a kind of important characteristic economy crops in xinjiang. It is very suitable for the growth of tomato in xinjiang. However, with the increasingly deepening of world trade, tomatoes are facing increasingly severe the dangers of all kinds of plant geminivirus. However, the existing technology and methods is difficult to realize broad-spectrum resistance to geminivirus in tomato. Therefore it has important practical significance to develop broad-spectrum geminivirus-resistant tomato. CRISPR/Cas9 system is one of immune systems which were used to defend bacteriophage in bacteria. It is first that CRISPR/Cas9 system will be used for antiviral breeding of tomato in this project. There are several highly conserved regions in different geminivirus genomes. In order to achieve broad-spectrum anti-geminivirus breeding of tomato, these conserved regions are used as the target of Cas9 in CRISPR/Cas9 system, which will establish important basis for high and stable yield of tomato in xinjiang.

番茄是新疆一种重要的特色经济作物，在新疆种植番茄具有得天独厚的优势。然而随着世界贸易的日益深入，番茄面临日趋严重的各种植物双生病毒的危害，而目前已有的技术方法难以在生产中实现番茄对多种双生病毒的广谱抗性。因此培育广谱抗双生病毒番茄品种具有重要意义。CRISPR/Cas9系统是细菌抵抗噬菌体侵染的一种免疫系统。本项目将首次把CRISPR/Cas9系统引入植物用于抗病毒育种。充分利用CRISPR/Cas9系统的特点，以不同双生病毒基因组序列中存在的高度保守区段作为Cas9的靶位点，构建CRISPR/Cas9系统，导入番茄中，以期实现番茄广谱抗双生病毒育种的目标，为新疆番茄高产稳产奠定重要基础。

番茄是新疆一种重要的特色经济作物，在新疆种植番茄具有得天独厚的优势。然而随着世界贸易的日益深入，番茄面临日趋严重的各种植物双生病毒的危害，因此培育广谱抗双生病毒番茄品种具有重要意义。然而目前已有的技术方法难以在生产中实现番茄对多种双生病毒的广谱抗性。CRISPR/Cas9系统是细菌在长期进化过程中形成的一种免疫系统，通过Cas9切割复制的噬菌体双链DNA，达到防御噬菌体的目的。目前该套防御机制已移植到植物体内并成功实现抗病毒的效果。依据CRISPR/Cas9系统抗病毒的原理，只有在各种双生病毒基因组序列上存在保守序列，且符合CRISPR/Cas9系统guide RNA的设计要求，才能实现对多种双生病毒的广谱抗性。我们首先建立了适用于番茄的CRISPR/Cas9系统，然后收集并分析了87种可以侵染番茄的双生病毒基因组序列，发现复制起始蛋白Rep基因在核苷酸序列上存在多处高度保守的序列，其中有2个区段符合guide RNA的设计要求。比对结果显示同时带这两个guide RNA（单PAM和双PAM）的CRISPR/Cas9系统理论上可以有效抵御至少57 种侵染番茄的双生病毒。该序列比对结果展示出令人兴奋的应用前景。然而有研究发现并不是所有的guide RNA都能引导Cas9蛋白靶向切割DNA，实现编辑。因此上述两个guide RNA能否能实现抗病毒效果还需要研究验证。首先我们创制了由2种U6启动子分别驱动上述两种guide RNA转录的4种稳定转化的番茄转基因材料，然后分别接种与单PAM的guide RNA完全匹配的番茄黄化曲叶病毒SH2和与双PAM的guide RNA完全匹配的经改造过的番茄黄化曲叶病毒mSH2。体内病毒积累量检测和发病病症分析结果显示带单PAM位点guide RNA的CRISPR/Cas9系统并不能有效地抑制番茄黄化曲叶病毒SH2的复制，但带双PAM位点guide RNA的CRISPR/Cas9系统可以抑制番茄黄化曲叶病毒mSH2的复制。我们所创制的带双PAM位点guide RNA的CRISPR/Cas9系统的番茄理论上可以实现同时对27种侵染番茄的双生病毒产生抗性。