P-糖蛋白介导术后腹膜粘连的研究

我们预实验发现多药耐药基因MDR1表达产物P-糖蛋白（P-gp）在腹膜粘连成纤维细胞高表达，抑制其活性能减轻腹膜粘连，提示其可能与术后腹膜粘连相关。那么，剖腹术如何诱导成纤维细胞高表达P-gp？P-gp又如何参与腹膜粘连的形成？目前尚未见报道。本项目拟在收集标本和建立动物模型的基础上：首先分析粘连和正常腹膜组织P-gp的表达差异，以及P-gp表达干预对腹膜粘连的影响，确定其在腹膜粘连中的重要作用；然后对腹膜损伤通过TGF-β1/Smads信号通路上调P-gp的表达进行研究，探讨剖腹术诱导成纤维细胞高表达P-gp的机理；最后通过P-gp调控容积激活性氯电流和细胞迁移的研究，探讨P-gp参与腹膜粘连形成的机制。期望最终阐明：剖腹术腹膜损伤→成纤维细胞P-gp表达上调→ 细胞迁移能力提高→腹膜粘连形成的机理。项目的实施将为腹膜粘连的有效防治提供新的靶点，也将为P-gp的功能研究开辟新方向。

P-gp是由多药耐药基因MDR1编码的一种ATP依赖跨膜转运蛋白，国内外研究者主要关注其在耐药方面的功能。术后腹膜粘连是长期困扰外科手术领域的一个重要问题。本项目在前期研究的基础上主要探讨：⑴ P-gp是否参与腹膜粘连的形成？⑵ 机械损伤、组织缺血等病因如何诱导成纤维细胞高表达P-gp？⑶ 高表达的P-gp参与腹膜粘连形成的机制如何？结果显示：⑴ 术后人和鼠腹膜粘连组织成纤维细胞P-gp表达明显高于正常腹膜组织；⑵ 与正常成纤维细胞比较，粘连成纤维细胞的回输明显加重术后腹膜粘连；⑶ 下调P-gp的表达，明显降低腹膜损伤导致的腹膜粘连的等级和程度；⑷ TGF-β1显著上调P-gp的表达；⑸ TGF-β1含量增加粘连鼠腹腔液回输至中度损伤鼠加重腹膜粘连的程度；⑹ 中度损伤鼠腹腔内注射TGF-β1加重腹膜粘连的程度，同时上调粘连组织P-gp的表达；⑺ TGF-β1受体抑制剂SB431542剂量依赖性地抑制TGF-β1诱导的P-gp表达的上调；⑻ 下调Smad2或Smad3的表达也抑制TGF-β1诱导的P-gp表达的上调；⑼ 乙酰化组蛋白H3与MDR1启动子结合；⑽ TGF-β1诱导组蛋白H3乙酰化增加，TGF-β1受体抑制、CBP/P300乙酰化酶抑制、下调Smad2的表达均能阻滞TGF-β1诱导组蛋白H3乙酰化;⑾ 组蛋白H3、Smad2或Smad3过表达增加MDR1启动子活性。⑿人或鼠粘连组织成纤维细胞迁移和增殖能力皆比培养的正常腹膜成纤维细胞强；⒀ 鼠粘连组织成纤维细胞容积激活性氯电流的电流密度比正常成纤维细胞的电流密度高；⒁ 粘连组织成纤维细胞容积调节能力（调节性容积回缩，RVD）也比正常成纤维细胞强；⒂下调P-gp的表达明显降低容积激活性氯电流的电流密度、RVD的能力以及减少细胞的迁移能力；⒃ P-gp表达增加促进ClC-3 342位酪氨酸的磷酸化，粘连成纤维细胞Src蛋白激酶Tyr416磷酸化明显增加，P-gp与Src蛋白激酶相互结合。本研究确证了P-gp在术后腹膜粘连形成过程中发挥了重要作用；手术损伤通过TGF-β1/Smad通路以及组蛋白H3乙酰化促进MDR1的表达从而上调P-gp的表达。表达上调的P-gp通过 Src蛋白激酶Tyr416磷酸化↑→342位酪氨酸磷酸化↑→ClC-3容积激活性氯电流↑→容积调节↑→细胞迁移和增殖↑最终导致腹膜粘连的形成。