棉铃虫P-糖蛋白介导的杀虫药剂跨细胞膜转运机制

Chemical control is an important approach in IPM. A lot of researches focus on the modification of molecular targets and the enhancement of detoxification in pest resistance to insecticides. Though most of molecular targets banding with insecticide are located on membrane or inner of cell, there are few investigations explaining for insecticide how to penetrate cell membrane of insects. The modification of multidrug resistance gene (MDR) coding P-glycoprotein (P-gp) can result in the efficient number of drug moledular dramatically decreasing in cell. This programme includes: 1) MDR gene clone and tissue-specific expression; 2) the dose and time relationship on effects of insecticides on MDR expression; 3) analysis of active sites banding with insecticides and banding specifity; 4) the role of the changes of MDR gene in protection cells of insects from imsecticdes. The research results will demonstrate the molecular mechanisms by modification of P-gp-mediated the reduction of insecticide moleculars in cells. It will be useful to clarify the multiple resistance mechanisms in Helicoverpa armigera.

化学防治是害虫治理的一项重要措施，随着杀虫药剂的使用害虫会不可避免的产生抗性。害虫抗药性的研究目前主要集中在分子靶标变异和解毒代谢改变，但是杀虫药剂的许多分子靶标位于细胞膜或细胞内，关于药剂如何穿透细胞膜以及害虫本身如何快速降低细胞内有毒物质的研究还是空白。MDR编码的P-糖蛋白（P-gp）发生改变会导致药物分子进入细胞膜的有效数量减少，从而导致其产生比较广的交互抗药性（或耐药性）。本项目从MDR基因克隆、组织表达专一性、杀虫药剂对其表达量影响的剂量和时间效应；P-gp与药剂结合位点功能分析及其药剂结合普测定以及P-gp变异对细胞免于杀虫药剂毒性保护作用的影响等方面进行研究。明确棉铃虫P-gp变异导致药剂在细胞内有效数量减少的分子机制，为揭示害虫的多抗性机制提供新的思路。

P－糖蛋白会导致药物分子进入细胞膜的有效数量减少，从而导致害虫产生比较广的交互抗药性（MDR）。运用RACE方法克隆并通过同源比对和结构域预测等方法确定得到棉铃虫多抗基因P-glycoprotein全长编码序列。在转录水平研究了2-十三烷酮、阿维菌素、溴氰菊酯和氯虫苯甲酰胺处理后棉铃虫中肠、脂肪体、体壁、头、马氏管组织中P-gp基因表达的时间和剂量效应，结果发现2-十三烷酮、阿维菌素、溴氰菊酯和氯虫苯甲酰都能不同程度的诱导棉铃虫不同组织的P-gp的表达，除溴氰菊酯外其余三种药剂处理均在中肠有较高的表达量，由于溴氰菊酯对脑神经的作用，其处理后24h头部的P-gp较其他三种药剂处理后的表达量相对较高。RNA干扰实验发现在12小时干扰效果最佳，其中饲喂棉铃虫P-gp　dsRNA的处理组，用2-十三烷酮处理后棉铃虫幼虫死亡率比dsGFP对照组升高了59%，同样用阿维菌素处理后，饲喂棉铃虫P-gp dsRNA的处理组比对照组死亡率升高了58%。免疫组化研究通过用不同药剂处理棉铃虫结果表明2-十三烷酮诱导P-gp在12h的表达量比阿维菌素诱导效果好，进一步说明P-gp基因在棉铃虫的多抗性中扮演重要角色。以SWISS-MODEL SPACE 为建模平台, 选取四个多抗基因（PDB ID:5kpi-A;4f4c-A;4q9H-A;4m1m-A）作为模板在线建模，其中以Caenorhabditis elegans的P-gp基因（PDB ID:4f4c-A）作为模板建立的棉铃虫P-gp三维模型的GMQE,QMEAN,ERRAT等评估参数均优于其他模板。棉铃虫P-gp３Ｄ模型的构建对于在蛋白水平揭示P-gp基因的抗性机理有重要的参考价值。采用EasySelect TM Pichia Expression Kit体外表达棉铃虫P-gp对于预测P-gp同药物的结合位点和体外观察P-gp的抗药性机理提供便利。.本文探讨了棉铃虫P-gp 作为多抗基因的重要组成部分来提高其适应能力的机制，对于揭示害虫的抗药性机制具有重要意义，还可为发展害虫控制新技术以及新农药创制提供依据。