ClC-3氯通道蛋白非离子通道途径调控膜皱褶和有丝分裂的研究

Chloride channel 3 (ClC-3) is one of approximately 13 members of the ClC family of voltage-gated chloride ion channels. The current studies mainly focus on the biological functions mediated by its ion channel properties. Our previous studies found that ClC-3 gathered in membrane ruffles and up-regulation or down-regulation of ClC-3 expression promoted or inhibited membrane ruffling, respectively, but the membrane ruffling wasn't affected by the intracellular or extracellular chloride channel blockers. Moreover, ClC-3 flows from the cytoplasm to the nucleus when cells progress from G2 phase to early mitosis, and was aggregated at the spindle poles and in between two chromosomes during metaphase and anaphase, respectively. These results suggest that ClC-3 may be involved in the regulation of membrane ruffling and mitosis via non-ion channel properties. This project aims, on the one hand, to determine the non-ion channel role of ClC-3 involved in membrane ruffling and to clarify the mechanism by which ClC-3 work as a signaling molecule to regulate β1 1 integrin recycling, and, on the other hand, to confirm non-ion channel functions of ClC-3 during mitosis and to elaborate the underlying mechanism by which ClC-3 regulate G2 / M phase transition and spindle formation and microtubule sliding as a cell cycle regulatory factors. The implementation of the project is expected to extend the research of the ClC-3 chloride channel protein multifunction, will also provide a new theoretical basis for the study of the mechanism of membrane ruffling and mitosis.

ClC-3是ClC氯通道家族的成员，当前主要关注其离子通道属性介导的生物学功能。我们在NSFC青年基金支持下前期发现：① ClC-3聚集于细胞膜皱褶处，干预ClC-3的表达影响膜皱褶的形成，但膜褶皱的出现不受胞内外氯通道阻断剂的影响；② 细胞周期G2/M期转换时，ClC-3从胞浆转运至胞核，且在有丝分裂中后期聚集于纺锤体两极和分离染色体的中间，这些结果提示ClC-3可能以非离子通道途径参与膜皱褶和有丝分裂的调控。本项目拟进一步深入研究，一方面确定ClC-3以非离子通道途径参与膜皱褶形成的作用，并阐明其作为信号分子调控角蛋白依赖性的β1整合素再循环的机理；另一方面明确ClC-3以非离子通道属性调控有丝分裂的功能，阐述其作为调控因子调节细胞G2/M期转换以及M期纺锤体形成和微管滑动的机制。项目的实施有望为ClC-3多功能的研究指引方向，也将为膜皱褶和有丝分裂调控机理的研究提供新的理论依据。

ClC-3是ClC氯通道家族的成员，当前的研究主要关注其离子通道属性介导的生物学功能。本项目在前期研究的基础上主要探讨：① ClC-3是否以非离子通道途径调控迁移细胞膜皱褶的形成？ 如果是，其调控机理是什么? ② ClC-3是否以非离子通道属性参与有丝分裂的调控？如果是，其调控机制如何？结果显示：⑴ 诱导胞膜ClC-3内吞抑制细胞膜皱褶的形成；⑵多途径抑制容积激活性氯电流对细胞膜皱褶的形成没影响；⑷下调ClC-3的表达抑制β1整合素从胞浆再循环至胞膜；⑸ ClC-3和β1整合素分别与角蛋白18（K18）在胞浆和膜皱褶处共定位且结合；⑹ 下调K18的表达抑制了EGF诱导的细胞膜皱褶、β1整合素再循环以及ClC-3在胞浆和胞膜间的运输；⑺ ClC-3过表达促进K18 S52位点的磷酸化，其表达下调抑制K18 S52位点的磷酸化；⑻ EGF刺激诱导细胞膜皱褶时K18 S52位点的磷酸化上升，下调ClC-3表达则抑制其上升；⑼ K18 S52位点突变抑制EGF刺激诱导的K18与β1整合素的结合；⑽有丝分裂早中期细胞胞内渗透ClC-3封闭性抗体或氯通道阻断剂阻滞细胞在M中期且抑制M期纺锤体的形成；⑾胞外氯通道阻断剂对同步化M期细胞释放后进入G1没有影响；⑿ 在不同细胞类型中，K18 pS52在有丝分裂期细胞的表达明显高于其它时期，ClC-3在有丝分裂期与K18 pS52共定位于中心体；⒀ K18 pS52在中心体的定位呈细胞周期依赖性：S期、G2期、M前、中和后期聚集于中心体，M末期及G1未聚集于中心体；⒁ K18 pS52定位在中心粒近端，与C-Nap1没有直接相互作用；⒂ K18 pS52定位在中心体需要依靠微管的作用，参与微管成核；⒃ K18 S52位点突变为Ala后，抑制了K18 pS52在中心体的定位；⒄ 抑制K18 pS52在中心体的定位，导致中心体分开。⒅ 抑制K18 pS52在中心体的定位抑制细胞增殖。本研究一方面确证了ClC-3通过非离子通道途径调控了细胞迁移过程中的膜皱褶并阐明其机理为通过影响K18的磷酸化从而调节β1整合素的在循环。另一方面证实了ClC-3以非离子通道属性参与了细胞有丝分裂调节，并初步明确其机理为有丝分裂过程中定位于中心体通过促进K18S52位点磷酸化参与中心体的连接和微管成核的调控。