Meq基因簇内病毒miRNA调控马立克氏病病毒（MDV）致病表型的功能研究

miRNA在多种生物学过程中发挥重要的基因调控功能，最新发现MDV也编码数十种miRNA基因，它们可能参与调控病毒的复制、潜伏感染、肿瘤发生等。MDV-1编码的miRNA主要形成3个基因簇，其中Meq基因簇位于最重要的原癌基因Meq上游，该簇内的miRNA可能在致病及致瘤中发挥关键作用。本课题拟在系统分析Meq基因簇内miRNA体内动态基因表达谱的基础上，利用细菌人工染色体技术（BAC）和Rec E/T同源重组系统构建该簇内miRNA单基因及Meq基因簇敲除的传染性BAC克隆、经动物实验研究该基因簇内miRNA基因敲除对MDV-1致病性的影响，最终鉴定调控MDV-1致病及致瘤表型的miRNA，为进一步阐明其分子调控机制奠定基础。MDV是目前唯一可用疫苗成功预防的致瘤性病毒，深入研究其编码的miRNA功能亦将为阐明miRNA调控肿瘤发生和发展的生物学、遗传学、以及免疫学等提供极好的动物模型。

为了揭示Meq基因簇miRNA对MDV致瘤表型的调控作用，本项目首先对MDV超强毒株GX0101编码的miRNA在宿主体内的动态表达谱进行了系统研究，发现这些miRNA在感染全程中具有明显的时序性和组织差异性表达特征，同时将22种miRNA中稳定表达12种分别归类为感染早期表达或感染晚期表达的miRNA。感染早期表达的miRNA在MDV感染后18和36天均具有明显的脾脏和肺脏特异性表达特征，但在感染后90天肉眼肿瘤发生期，虽然没有观察到miRNA的肿瘤特异性表达、但却存在着明显的组织差异性，其中以脾脏、肺脏或胸腺中的表达量最高。与早期表达miRNA相比，晚期表达miRNA虽然只在肉眼肿瘤发生期表达，但它们在不同组织脏器中的表达差异性更显著。.利用细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome，BAC）技术，在GX0101的基础上构建了Meq-miRNA基因簇和mdv1-miR-M4单基因缺失的BAC克隆并拯救出了感染性病毒克隆，分别命名为GX△Meq-miRs和GX△miR-M4，进一步通过动物攻毒实验对miRNA基因缺失后的致病性进行了研究。结果发现，Meq基因簇miRNA对MDV的复制是非必需的，且对病毒在体内的早期复制及潜伏感染没有影响。然而，miRNA基因缺失后MDV的致病性及致瘤性均发生了显著改变。与亲本毒株GX0101相比，GXΔMeq-miRs和GXΔmiR-M4的致死率分别由100%下降至18%和4%；攻毒后75天时感染鸡的肉眼观察的肿瘤发生率分别由28%下降至22%和8%。这表明Meq基因簇miRNA对MDV的致病及致瘤表型具有重要的调控作用，其中mdv1-miR-M4是MDV致瘤最重要的调控因子之一，但单独敲除该基因并不能完全缺失MDV的致瘤性；除mdv1-miR-M4之外，Meq基因簇内编码的其它miRNA分子对MDV的致病及致瘤表型也极有可能具有重要的调控作用。.本项目的部分研究结果已在Virology, J Gen Virol等国际知名的病毒学杂志上发表论文4篇（SCI收录），为今后进一步研究Meq基因簇内其它病毒miRNA与MDV致瘤表型的关系奠定了重要基础，并为解析mdv1-miR-M4调控MDV致瘤的分子机制提供了重要研究材料。