苜蓿中华根瘤菌对有机砷的还原及其分子机制研究

The widely-used pentavalent organoarsenicals could be microbially degraded to more toxic inorganic arsenite, which causes environmental pollution and health problem. Microbial-mediated reduction is the key process in organoarsenical biodegradation, while its molecular mechanisms are poorly characterized. In this project, four typical organoarsenical compounds (monomethylarsenite, p-arsanilic acid, nitarsone and roxarsone) will be used to investigate the organoarsenical reduction and its molecular mechanisms by model bacterium Sinorhizobium meliloti Rm1021. HPLC-ICP-MS will be used to detect the products when Sinorhizobium meliloti Rm1021 exposed to organoarsenicals for the indicated times. A genome library containing selection plasmid will be used to identify the gene(s) responsible for arsenate group reduction of organoarsenicals. Homologous sequence alignment and multi-stage protein separation will be used to investigate the nitroreductase(s) for nitro group reduction of aromatic arsenicals. The putative reductases will be verified by in vitro assays and biochemical characterized. This project will give insights into arsenic biogeochemical cycles, and provide scientific evidences for bioremediation of arsenic contamination.

农业生产中广泛使用的五价有机砷化合物可被微生物降解成高毒的无机砷，造成环境污染并威胁人体健康。微生物参与的还原反应是有机砷化合物降解的关键环节，然而目前关于微生物介导下有机砷化合物还原的分子机制研究鲜有报道。本项目以模式微生物苜蓿中华根瘤菌为研究对象，探究其对单甲基砷，阿散酸，洛克沙胂和硝基苯砷四种典型有机砷化合物的还原途径及其分子机制。采用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用技术对苜蓿中华根瘤菌有机砷还原产物进行时间梯度分析，初探降解途径；利用前期所构建的筛选质粒对苜蓿中华根瘤菌基因组文库中五价有机砷还原酶基因进行筛选；通过同源序列比对和多级蛋白质分离对参与芳香族砷化合物硝基还原的基因进行鉴定；对假定的有机砷五价砷基团和硝基基团还原酶进行体外活性验证和酶学特性分析；明确苜蓿中华根瘤菌参与有机砷还原的关键酶。研究成果为阐明砷生物地球化学循环提供新视角，为砷污染生物修复提供科学依据。

大量的五价有机砷化合物在过去的几十年中常作为除草剂或动物生长促进剂，广泛用于农业生产活动中。然而，这些五价有机砷化合物在环境中可被微生物降解成高毒的无机砷，造成环境污染并威胁人体健康。微生物参与的还原反应是有机砷降解的关键环节。因此，本项目以苜蓿中华根瘤菌为研究对象，探究其对单甲基砷[MAs(V)]，阿散酸[pAsA(V)]，洛克沙胂[Rox(V)]和硝基苯砷[Nit(V)]四种典型有机砷化合物的还原途径及其分子机制。研究结果表明：（1）苜蓿中华根瘤菌可将MAs(V)和pAsA(V)还原成对应的三价形态[MAs(III)和pAsA(III)]。此外，苜蓿中华根瘤菌还可首先将Rox(V)和Nit(V)的硝基基团还原为氨基基团，分别生成3-氨基-4-羟基苯砷酸[HAPA(V)]和pAsA(V)；并再次将HAPA(V)和pAsA(V)的五价砷基团还原，分别生成HAPA(III)和pAsA(III)。（2）苜蓿中华根瘤菌和含有C-As键裂解酶基因（arsI）的链霉菌（Streptomyces sp. MD1）共培养，可将五价有机砷[MAs(V)、PAsA(V)、Rox(V)和Nit(V)]彻底降解为三价无机砷[As(III)]。（3）苜蓿中华根瘤菌中依赖于FAD和NADPH的硝基还原酶（MdaB）经鉴定为催化含硝基芳香族有机砷[Rox(V)和Nit(V)]硝基基团还原的关键酶，并可在额外添加FAD、NADPH和GSH/TCEP的体外反应体系中，将Rox(V)和Nit(V)的硝基基团还原为氨基基团。（4）通过转录组测序分析，与对照组相比，苜蓿中华根瘤菌在MAs(V)和Rox(V)胁迫下，分别筛选出差异表达基因2229个和276个，对获得的差异基因进行功能注释及富集分析，发现苜蓿中华根瘤菌中包括核糖体等多种通路受到有机砷胁迫的影响。研究成果为阐明砷生物地球化学循环提供新视角，为砷污染生物修复提供科学依据。