核糖体蛋白RPS5与抗肝纤维化药物复合物的结构研究

Our resent researches was initiated to address that ribosomal protein 5S （RPS5） plays a critical role in hepatic fibrosis. Matrine, its derivative M19 and luteolin, which occurred anti-hepatic fibrosis activity, can specially bind to RPS5, and the pharmacological experiments confirmed that RPS5 participates in the anti-hepatic fibrosis process of those compounds in a certain pattern. These results indicate that RPS5 is one of the new targets for treatment of hepatic fibrosis. However, the binding sites of RPS5 to these compounds are not clear. In this project, we are going to (1) express, isolate and purify the human RPS5 protein, and investigate the binding properties of RPS5 with M19 and luteolin；（2） fix out the binding sites by solving the crystal structures of the RPS5-M19/luteolin adducts，(3) determine the key sites involved in the interaction between RPS5 and M19/luteolin by comparing the binding properties of RPS5 mutants to M19/luteotin with those of native protein, and (4) establish molecule structural model to design new derivatives of M19 and luteolin against hepatic fibrosis on the target of RPS5. The research would illustrate the mechanism of matrine derivatives/luteotin against hepatic fibrosis, and collect the theoretical and experimental evidences on RPS5 acting as the new target for newly designed anti-hepatic fibrosis drugs.

我们近期研究发现核糖体蛋白RPS5在肝纤维化中起重要作用：具有抗肝纤维化作用的苦参碱及其衍生物M19以及木犀草素（Lut）等能特异性结合RPS5，药理实验证明这些化合物至少部分通过RPS5发挥抗肝纤维化作用，即RPS5是肝纤维化治疗的新靶点。但是，这些化合物与RPS5的结合位点仍为空白。本项目拟通过表达纯化出人的RPS5，研究RPS5与M19、Lut等化合物的结合性质，并培养两者复合物晶体，解析其晶体结构，分析其结合位点，再对RPS5进行突变，研究蛋白突变体与化合物的结合性质并确定其关键结合位点；在此基础上，构建以RPS5为靶点的结构模型，设计M19和Lut的新型衍生物。研究结果可在分子结构基础上阐明这些化合物的抗肝纤维化机制，并为以RPS5作靶点设计新型抗肝纤维化药物提供理论和实验依据。

核糖体存在于所有生命体中，是蛋白翻译的重要场所。核糖体蛋白S5（Ribosomal protein S5，RPS5）是真核生物核糖体40S亚基上的蛋白，为细胞活性所必需。RPS5在蛋白翻译中所具有的重要作用是：能与激发因子eIF2结合，影响引发效率从而调节蛋白的翻译过程。研究发现RPS5还具有许多核糖体外功能，如与细胞的分化和凋亡有关，参与肝炎和肝纤维化过程等。研究发现，抗肝纤维化中药药物苦参碱以RPS5为作用靶分子。木犀草素（luteolin）是一种天然黄酮类化合物，具有多种药理活性，临床主要用于止咳祛痰、治疗心血管疾病、肝炎等。本课题基于人的核糖体S40的Cryo-EM结构中的RPS5的结构，通过计算机模拟研究发现RPS5与木犀草素的结合强于苦参碱及其衍生物M19。RPS5与木犀草素可能的区域（氨基酸位点）为：区域1（ARG81、MET75、LYS85、ARG159）、区域2（ARG60、LYS63、ARG145）、区域3（LYS18、LYS42、LYS44）、区域4（LYS201、LYS204）、区域5（LYS63、HIS79、TRP152）和区域6（ARG122、Lys193）。基于人的RPS5的同源体原核生物掘越氏热球菌的RPS7的晶体结构，通过模拟研究及序列对比，进一步确定RPS5中的LYS63、ARG81、LYS85、ASP140、ARG145、LYS193最有可能是其与木犀草素的结合位点。通过克隆表达和纯化RPS5蛋白并将RPS5的上述可能的结合位点进行单点或双点突变，表达突变体蛋白（K63A、R81A、K85A、R81A/K85A、K63A/R145A），利用Biacore、OCTXT测定木犀草素与突变体蛋白的结合常数，结果显示LYS63、ARG81、LYS85、ARG145都可能是RPS5与木犀草素的结合位点。其他位点的突变体的克隆表达及最终结合位点的确定仍在进一步研究中。RPS5与木犀草素的结合位点的确定，将为木犀草素作为抗肝纤维化药物的作用机制及设计新型抗肝纤维化药物提供理论和实验依据。