核糖体蛋白RPS5（PP2C磷酸酶新成员）的作用底物及其肝纤维化相关信号通路的研究

Our previous study have found that the matrine derivative MASM specifically bind to and stabilize the ribosomal protein RPS5, inhibition of hepatic stellate cells (HSC) activation and has significant role in anti liver fibrosis. Further study showed that RPS5 could modulate of HSC activation and hepatic fibrosis through dephosphorylating the Akt kinase and has the function of PP2C protein phosphatase. Our recent studies suggest that GSK3-beta and ERK are potential substrates. This project around the role of RPS5 with the phosphatase function in liver fibrosis intends to further clarify and screen RPS5 substrates and their participation in the regulation of signaling pathways associated with liver fibrosis, while research on molecular mechanism of liver fibrosis by MASM. The role of RPS5 in liver fibrosis and antifibrotic mechanism of MASM will be further confirmed by transgenic and liver specific knockout mice combining with liver fibrosis model. The results could clarify the substrates of RPS5 and the regulation of signaling pathways. The role of RPS5 would be further clarified in the pathogenesis of liver fibrosis, providing clues for the diagnosis and prevention of liver fibrosis. The antifibrotic mechanism of MASM would be further clarified, providing theoretical basis for its development and treatment of liver fibrosis.

我们前期研究发现苦参碱衍生物MASM能特异结合并稳定核糖体蛋白RPS5，抑制肝星状细胞（HSC）活化以及具有显著的抗肝纤维化作用。进一步研究表明RPS5通过对p-AKT去磷酸化调控HSC活化和肝纤维化，具有PP2C蛋白磷酸酶的功能。我们最近的研究提示GSK3β和ERK是 RPS5潜在的底物。本项目围绕RPS5具有磷酸酶的核糖体外功能的特性，在肝纤维化中起重要作用，进一步明确和筛选RPS5的底物及其参与调控的与肝纤维化相关的信号通路，同时研究 MASM抗肝纤维化的分子机制。通过转基因和肝组织特异基因剔除小鼠模型，进一步确证RPS5在肝纤维化中的作用和MASM抗肝纤维化的机制。研究结果可以更深入阐明RPS5的具体的作用底物和信号通路及其在肝纤维化发病中的机理，为肝纤维化的诊断和防治提供线索；同时进一步阐明MASM抗肝纤维化的分子机制，为其开发为肝纤维化治疗新药提供理论依据。

前期研究发现RPS5通过对p-AKT去磷酸化调控HSC活化和肝纤维化，具有PP2C蛋白磷酸酶的功能。本项目围绕RPS5具有PP2C蛋白磷酸酶的核糖体外功能的特性，发现RPS5能够同p-AKT/AKT、GSK3β相互作用，且有PP2C磷酸磷酸酶活性。其中RPS5-D140A是RPS5的显性负性突变体，虽然丧失磷酸酶活性，但仍然具有RPS5作为核糖体蛋白的蛋白合成功能，表明磷酸酶活性和蛋白合成功能的分离。而苦参碱衍生物MASM能够促进RPS5对p-AKT和GSK3β脱磷酸化作用，是RPS5的激动剂。这进一步阐明了RPS5调控肝纤维化的分子作用机制，RPS5作为肝纤维化治疗靶点的可能性，同时，明确了MASM的分子作用机制，为抗肝纤维化药物的研究提供理论依据。. 首先，我们构建了以HSC特异性启动子GFa2为启动子的RPS5干扰腺病毒，然后分别在体内和体外证实选择性敲减HSC的RPS5水平能够促进HSC的活化和肝纤维化发展进程。在此基础上，我们构建了HSC条件性敲除RPS5的基因敲除小鼠（RPS5Flox/Flox/GFAP-Cre+），发现该小鼠较对照小鼠体型小，体重约为对照小鼠的1/3，体弱，肝重指数约为对照小鼠的73%，极易死亡，肝脏组织免疫组化结果显示肝脏细胞增殖受阻。综上表明RPS5是肝脏正常生长所必需的基因，也是肝纤维化重要的易感基因，是设计抗肝纤维化药物的潜在靶点。这不仅是药物研究的创新，同时也是发现新的药物靶点的创新，具有重要的理论意义和应用前景。. 此外，我们发现MASM可能通过MAPK等通路发挥抗辐射损伤的作用；MASM还能够通过抑制干细胞相关基因的表达与促进成熟肝细胞标志物的表达，抑制肝癌细胞增殖和克隆形成，从而促进肝癌干细胞向肝细胞分化。在动物模型中，MASM能够抑制肝癌细胞异种移植瘤的生长，减少肿瘤干细胞比例。MASM可能通过PI-3K/AKT和GSK3β/β-catenin通路发挥作用。这些研究结果和发现为应用MASM作为抗辐射损伤与肝癌治疗候选药物提供依据，具有重要的实际意义。