基于核糖体蛋白S5的木犀草素抗肝纤维化新靶点及机制研究

Our previous NSFC research have found that luteolin exhibits potent antifibrotic effects on hepatic fibrosis and inhibits AKT activation of hepatic stellate cells (HSC), but the mechanisms and targets involved are unknown. Further, luteolin binds to ribosomal protein S5 (RPS5) and inhibits the activity of casein Kinase II (CK2) in HSC, which interacts with RPS5 specificly. RPS5, as a potential therapeutic target of hepatic fibrosis, suppresses AKT activation and plays an important role in the development of hepatic fibrosis. Based on these studies, we propose that RPS5 may be an important antifibrotic target for luteolin on hepatic fibrosis. This research will investigate the effects of luteolin on RPS5 content and activity. Furthermore, we will research whether RPS5 mediates its antifibrotic effects by using RPS5 siRNA and RPS5 D140A mutant. The results will not only clarify the molecular mechanisms and tatget of luteolin on hepatic fibrosis and confirm RPS5 as a target for drug interference, but also provide a new strategy for the development of more antifibrotic drugs.

在前期国家自然科学基金研究中我们发现木犀草素具有良好的抗肝纤维化作用，能抑制肝星状细胞（HSC）中AKT的活化，但其抑制AKT活化的具体作用机制、靶点不明。表面等离子共振实验（SPR）进一步发现木犀草素能与核糖体蛋白RPS5结合，并在HSC中抑制RPS5特异性结合蛋白-蛋白激酶CK2的活性。RPS5直接影响AKT的活化，鉴于RPS5在肝纤维化中有重要作用，是抗肝纤维化治疗的潜在靶标，我们提出假说：RPS5是木犀草素抗肝纤维化的一个重要靶点。本项目拟利用RPS5 siRNA以及RPS5 D140A突变体，体内外研究木犀草素对RPS5含量及活性的影响及RPS5是否介导其抗肝纤维化作用。研究结果阐明木犀草素抗肝纤维化的分子作用机制及靶点，确证RPS5在肝纤维化过程中的靶标作用，为更多抗肝纤维化药物的开发研究提供新的研究思路。

肝纤维化是各种病因所致慢性肝损伤的修复反应，其主要特征是细胞外基质的过度沉积。在肝纤维化形成过程中，肝星状细胞的活化发生了至关重要的作用。研究表明肝纤维化是一个可逆过程，因此，寻找并发现新的影响肝纤维化进程的作用靶点和抗肝纤维化药物对肝纤维化的治疗具有重要意义。本课题组前期研究发现，木犀草素具有良好的抗肝纤维化作用，能够抑制肝星状细胞（HSC）中AKT的活化，但其抑制AKT活化的具体作用机制、靶点不明。我们前期应用表面等离子共振实验（SPR）进一步发现木犀草素能与核糖体蛋白RPS5结合，并在HSC中抑制RPS5特异性结合蛋白-蛋白激酶CK2的活性。RPS5直接影响AKT的活化，鉴于RPS5在肝纤维化中有重要作用，是抗肝纤维化治疗的潜在靶标，因此本项目主要对RPS5是否为木犀草素抗肝纤维化靶点进行探索。一是验证了木犀草素能与RPS5蛋白特异性结合，并调节RPS5蛋白功能。实验发现木犀草在HSC细胞内能与RPS5结合，增加RPS5蛋白含量，体外也能与RPS5重组蛋白特异性结合，并增加其蛋白稳定性；RPS5具有磷酸酶活性，介导AKT蛋白的脱磷酸化，木犀草素能增加RPS5的磷酸酶活性，并能抑制RPS5相互作用蛋白AKT、GSK-3β磷酸化。二是验证了RPS5介导了木犀草素的抗肝纤维化作用。实验表明在RPS5存在的条件下，木犀草素可以抑制HSC-T6细胞的增殖、α-SMA的表达以及AKT的磷酸化，而RPS5敲减以后，木犀草素的作用大大减弱，表明RPS5介导了木犀草素对肝星状细胞增殖和活化的抑制作用；采用携带靶向RPS5基因的小干扰腺病毒尾静脉注射肝纤维化大鼠，结果发现在RPS5干扰后，木犀草素对大鼠肝纤维化的抑制作用不明显，并且对AKT活化的抑制作用也减弱，证实RPS5是木犀草素抗肝纤维化的一个靶点。此外通过对RPS5蛋白氨基酸序列对比及空间结构拟合，我们找到了RPS5蛋白活性中心，并构建了其点突变体D140A，为下一步木犀草素的结构改造打下了基础。综上所述，本课题进一步阐明了木犀草素抗肝纤维化的机制，明确了木犀草素的分子作用靶点，确证 RPS5 在肝纤维化治疗中的靶标作用，为抗肝纤维化药物的开发提供新的策略。